separação da hemoglobina e da albumina por cromatografia de troca iónica

Separação da hemoglobina e da albumina por cromatografia de troca iónica
Objectivos:
Separar as proteínas hemoglobina e albumina por cromatografia de troca iónica com uma absorvância a λ=280nm;
Apresentar os valores de absorvância numa tabela;
Construir uma curva padrão através da D.O. e da concentração da solução dos tubos de ensaio 1 a 14, identificando os picos;
Analisar os resultados obtidos.

Resultados:
Tabela 1 – Valores de absorvância das proteínas separadas por cromatografia de troca iónica. Tubos com frações de 1 ml
Absorvância (λ=280nm)
1
2.090
2
2.144
3
2.516
4
2.438
5
2.396
6
2.384
7
2.363
8
2.375
9
2.590
10
0.471
11
0.390
12
0.347
13
0.331
14
0.330

Gráfico 1 - Curva que relaciona a absorvância com a concentração dos tubos de ensaio.

Discussão dos resultados:
Para a separação das proteínas por cromatografia de troca iónica utilizou-se uma coluna de DEAE-Celulose como fase estacionária.
A DEAE-Celulose é uma resina positivamente carregada, sendo usada para o fracionamento de moléculas negativamente carregadas, como o caso da Hemoglobina e da Albumina. Estas proteínas apresentam carga negativa devido ao PH da fase móvel ser superior ao PI de cada uma das proteínas, logo ambas são atraídas pela carga positiva da fase estacionária. No entanto, a Hemoglobina apresenta um PI (6.9) mais próximo do PH (7.5), o que a torna menos eletronegativa em relação a Albumina. A Albumina apresenta um PI (4.7) bastante baixo relativamente ao PH (7.5), o que a torna mais negativa e consequentemente mais difícil de remover da fase estacionária.
Portanto, a Albumina é a proteína com maior afinidade á fase estacionária, pelo que é a ultima a sair. A Hemoglobina é a proteína que tem menor afinidade com a fase estacionária saindo em primeiro lugar.
De acordo com os resultados obtidos da experiência, pode-se verificar no gráfico 1 a existência de dois picos em 2.516 e