separacao celular

Separacao de Celulas por gradiente de densidade

A separação celular baseada no gradiente de Ficoll permite a separação dos leucócitos de acordo com um gradiente de densidade.

1. Colocar o Ficoll em tubo falcon de 15ml e gentilmente adicionar a amostra sobre o ficoll. Deve-se colocar lentamente a amostra sobre o ficoll para que não haja a mistura dos mesmos. A proporção ficoll/amostra é de 1:2.
2. Centrifugar por 30 minutos a 400g – 1600-1800 rpm (temperatura ambiente). Após a centrifugação aspirar vagarosamente a camada de células realizando movimentos circulares para assegurar que todas as células foram coletadas no procedimento.
3. Fazer uma lavagem dessas células coletadas com PBS, centrifugando-se a 450g/1800rpm por 5 minutos a temperatura ambiente.
MARCAÇÃO DA SUPERFICIE CELULAR COM ANTICORPOS PARA CITOMETRIA DE FLUXO

Na caracterização das leucemias por citometria de fluxo, utilizam-se anticorpos marcados para a identificação das linhagens e maturação das células

REAGENTES:

1. PBSA 1X
2. Paraformaldeído 0,5%
3. Anticorpos Monoclonais

MÉTODO:

1. Colocar entre 5x105 - 1x106 células suspensas em 50ul de PBS em tubos 5 ml, 25x75mm (Becton Dickinson 352052)
2. Adicionar quantidades apropriadas dos anticorpos monoclonais.
3. Misturar e incubar por 10 minutos a temperatura ambiente e no escuro.
4. Adicionar 1 ml de PBSA e centrifugar por 2 minutos e a 400-450 x g. Desprezar o sobrenadante. Repetir esta operação de lavagem.
5. Após a última lavagem ressuspender o pellet em 250-500ul (350ul) de paraformaldeído 0,5%. Os tubos podem ser analisados imediatamente ou estocados por no Maximo 1 semana a 40C.