Reacção de polimerase em cadeia – PCR

PCR é uma reacção de amplificação exponencial de um fragmento de DNA por síntese in vitro.
Para a reacção é necessária uma mistura de componentes essenciais para a replicação cíclica do DNA ocorrer:  DNA polimerase;
 Nucleótidos (dNTP’s);
 “Primers” (oligonucleótiodos iniciadores de síntese);
 DNA molde;
 Um tampão adequado para a actividade máxima da enzima usada;
 Mg2+.
A eficácia da reacção depende sobretudo do correcto emparelhamento dos primers de modo a que seja a sequência entre eles a amplificada.
É através da manipulação da temperatura, alternando-se diferentes temperaturas de modo a existirem fases de desnaturação e fases de emparelhamento, que se vão realizando ciclos e daí resultando cada vez mais cópias do DNA molde.
Numa reacção PCR, cada ciclo compreende 3 passos realizados com alteração da temperatura:
 A 94 ºC ocorre a desnaturação da dupla cadeia de DNA;
 Entre os 50 e 60ºC ocorre o emparelhamento dos “primers”
 A 72ºC ocorre o alongamento da cadeia filha por acção da polimerase.
No emparelhamento executa-se o passo a temperaturas relativamente elevadas mas sem se aproximar da temperatura óptima de acção da polimerase.
Com a aplicação de polimerases termorresistentes como a Taq polimerase isolada da bactéria termofílica
Thermus aquaticus, o passo de emparelhamento pode ser executado a 50ºC.

O produto do PCR é depois visualizado através de eletroforese em gel de agarose e o peso dos fragmentos de DNA pode ser estimado por comparação com um marcador específico.
O grupo analisou a pista 3, em que a mesma apresenta apenas uma banda específica de DNA bem definida no gel de agarose o que significa que os “primers” emparelharam corretamente, dando origem a fragmentos todos do mesmo tamanho e correspondentes à sequencia desejada e não houve contaminação exterior da amostra durante todo o processo.