Purificação de proteínas

Páginas: 5 (1055 palavras) Publicado: 16 de fevereiro de 2015
COLÓQUIO DAS PRÁTICAS 7 E 8: PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
(SDS-PAGE)

Pré-prática 7: Diálise
A partir das frações purificadas do lisado
(Saccharomyces cerevisiae) – cromatografia de troca
iônica.
Preparação da amostra para separação SDS-PAGE
através da diálise (para remoção de íons que
atrapalham nas análises posteriores).
Preparação concluída pela professora/técnicos.

2

O que é adiálise?
Separação por diferenças de peso molecular;
Membrana semipermeável;
Força motriz: diferença de concentração em lados
opostos (difusão);
Passagem de solutos menores e retenção de solutos
maiores;
Separação com base na rejeição de tamanho.

3

Quantificação de proteínas
A partir dessas amostras purificadas, devemos
proceder como na Prática 3 (Quantificação de Proteínas).
Jápossuímos a curva padrão de albumina.
Realizar leituras da amostra em 595nm (com as
devidas diluições indicadas no procedimento do
experimento – Tabela 2).
Determinar a massa de proteína por volume.

4

Prática 7: Preparação do Gel


Copolimerização
química
de
monômeros de acrilamida com N,N’metilenobisacrilamida (Bis-acrilamida)
na presença de persulfato de amônio etetrametiletilenodiamina (TEMED).
O TEMED catalisa a liberação de
radicais livres do persulfato que, por
sua vez, iniciam e aceleram a
polimerização.

Malha de Poliacrilamida

5

Prática 7: Preparação do Gel
Gel de Separação
•4,0 mL de água destilada,
•100 μL de SDS (100 g/L),
•3,33 mL da solução 1 (acrilamida e bis-acrilamida)
2,5 mL da solução 2 (Tris 1,5 M pH 8,8) *
•5 μL TEMED
•50 μL depersulfato de amônio

Adição do SDS:
•Interação da proteína com SDS deixa
a proteína com carga total negativa
•Desnatura a proteína na formação de
complexo SDS:Proteína

• Adquirem uma forma alongada
em forma de tubo cercada de várias
moléculas de SDS ao longo da
cadeia.

6

Prática 7: Preparação do Gel
Gel de Empilhamento
•3,5 mL de água destilada,
•50 μL de SDS (100 g/L),
•0,65mL da solução 1 (acrilamida e bis-acrilamida)
1,25 mL da solução 3 (Tris 0,5 M pH 6,8) *
•5 μL TEMED
•25 μL de solução de persulfato de amônio.

* Explicação durante a prática 8

7

Prática 7: Preparação do Gel
Desnaturação das proteínas
Adição do
tampão
Vf = 25µL
Amostra
100µg

Albumina
100µg

Hemoglobina
100µg

Adição do
tampão
Vf = 25µL

Aquecimento
(10minutos)Adição do
tampão
Vf = 25µL
8

Prática 7: Preparação do Gel
1. Tampão
• SDS: liga-se fortemente à proteína desnaturando-a. A proteína adquire
uma forma alongada em forma de tubo cercada de várias moléculas de
SDS ao longo da cadeia


β-mercaptoetanol: reduz as pontes de disulfeto que auxiliam a manter a
estrutura terciária



Glicerol: Aumenta a densidade final da amostra,fazendo com que ela
permaneça no fundo do pocinho de aplicação



Azul de bromofenol: permite a visualização da corrida eletroforética

2. Banho
• Auxilia no processo de desnaturação proteica

9

Por que desnaturar?
Proteínas apresentam diferentes cargas de acordo com pI e pH
do meio, logo seria difícil fazer com que todas corressem para
o mesmo lado quando aplicada a tensão.

10 Prática 8: A Eletroforese
A eletroforese consiste na migração de moléculas ionizadas, de
acordo com suas cargas elétricas e pesos moleculares em campo
elétrico .
Moléculas com carga negativa migram para o polo positivo
(ânodo) e moléculas com carga positiva migram para o polo
negativo (cátodo).
A velocidade de migração das moléculas é proporcional ao campo
elétrico e inversamenteproporcional ao seu volume molecular:
Moléculas com menor volume molecular irão migrar mais
rapidamente e as que possuem maior volume molecular irão
migrar mais lentamente.

11

Prática 8: A Eletroforese

12

Prática 8: Eletroforese
• A amostra não é aplicada diretamente no gel de separação e sim sob uma
camada gel de empilhamento, que possui poros grandes
• O objetivo é concentrar a...
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