protocolo de extração de DNA - conforme instruções do fabricante

Isolamento de DNA genômico de bactérias Gram positivas e Gram-negativas
(kit PROMEGA- Wizard Genomic DNA Purification Kit TM050)

Materiais a serem fornecidos pelo usuário:
• tubos de microcentrífuga de 1,5 ml;
• Banho de água, 80°C;
• Banho de água, 37°C;
• isopropanol, à temperatura ambiente; (gelado)
• 70% de etanol, em temperatura ambiente; (gelado)
• Banho Maria, 65°C (opcional; DNA para reidratação rápida);
• 50 mM EDTA (pH 8,0) (para as bactérias gram-positivas);
• 10mg/ml de lisozima (Cat Sigma. # L7651) (para as bactérias gram-positivas);
• 10mg/ml de lysostaphin (Cat Sigma. # L7386) (para as bactérias gram-positivas).

1. Adicionar 1ml de uma cultura overnight em tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Centrifugar a 13,000-16,000 × g por 2 minutos para sedimentar as células. Remova o sobrenadante. Para bactérias Gram positivas, vá para a Etapa 3. Para Bactérias Gram Negativa ir diretamente para a Etapa 6.
3. Ressuspender as células completamente em 480μl de EDTA 50mM.
4. Adicionar a apropriada enzima de lise ao sedimento celular ressuspenso em um volume total de 120μl, e pipetar gentilmente o mix. O objetivo deste pré-tratamento é enfraquecer a parede celular de modo que a lise celular eficiente possa ocorrer. (lisozima)

Nota: Para certas espécies de Staphylococcus, uma mistura de 60μl de 10mg/ml de lisozima e 60μl 10mg/ml de lysostaphin é necessário para lise eficiente. No entanto, muitas bactérias Gram de amostras positivas (por exemplo, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, otitidiscaviarum Nocardia, Rhodococcus rhodochrous e Brevibacterium albidium) lyse eficiente utilizando lisozima sozinho.

5. Incubar a amostra a 37°C por 30-60 minutos. Centrifugar por 2 minutos em 13,000-16,000 g × e remover o sobrenadante.
6. Adicionar 600μl de Nuclei Lysis Solution. Pipeta suavemente até que as células estejam ressuspensas.
7. Incubar a 80°C por 5 minutos para lisar as células; (depois esfriar a amostra a Tº ambiente).
8. Adicionar 3μl da