protocolo atividade enzimatica
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Protocolo fornecido pelo Laboratório de Farmacologia da Dor e NeuromodulaçãoUFRGS.Referência: Oses JP, Cardoso CM, Germano RA, Kirst IB, Rucker B, Furstenau CR, Wink
MR, Bonan CD, Battastini AM, Sarkis JJ: Soluble NTPDase: An additional system of nucleotide hydrolysis in rat blood serum. Life Sci 2004, 74(26):3275-84.
ATIVIDADE DE ENZIMAS DO SISTEMA PURINÉRGICO
1) Identificar e conferir todo o material necessário.
2) Identificar os eppendorfs (1,5mL) de acordo com a tabela abaixo ou seja, 2 eppendorfs “controles” e 3 eppendorfs “amostra”, para cada amostra, para tanto você terá, controles sendo feitos em duplicata e amostra em triplicata. Os eppendorfs devem ser marcados nas tampas com canetas de cores diferentes, afim de serem facilmente identificados os nucleotídeos.
ATP: com canetinha vermelha
ADP: Azul
AMP: verde ou preta.
ATP
ATP
ADP
ADP
AMP
AMP
C1
C2
C1
C2
C1
C2
C1
C2
C1
C2
C1
C2
A1
A2
A1
A2
A1
A2
A1
A2
A1
A2
A1
A2
A1
A2
A1
A2
A1
A2
C = Controle
A= Amostra
3) Separe um eppendorf para o BRANCO. Escreva um B na tampa do eppendorf.
4) Nos tubos identifcados adicionar 50 µL de Tris-HCl 450mM pH 7,5 +70 µL de água Milli-Q e 20 µL de soro. ATENÇÃO: Adicionar os 20 µL de soro somente dos eppendorfs “A” (amostra) e não nos “C” (controles).
5) Prepare o tubo B = TUBO BRANCO: somente 50 µL de Tris-HCl e 150 µL água (NÃO colocar nucleotídeo no momento da incubação).
6) Coloque todos os eppendorfs preparados em estantes de eppendorfs em ordem de pipetação, sempre começando pelos controles.
7) Coloque a estante com os tubos dentro do banho-maria a 37°C por 10 minutos, para que o meio de incubação possa ficar em temperatura ideal para reação enzimática. 8) Coloque 60 µL de nucleotídeo a 10mM, nos tubos identificados, ou seja, naqueles que estará sendo analisada a hidrólise de ATP, coloque 60 µL do nucleotídeo ATP no C1, C1,