PR TICA DE ATIVIDADE LIPOL TICA

PRÁTICA DE ATIVIDADE LIPOLÍTICA – Lípase Cândida antactica (Novozyme 435)

METODOLOGIA

1) Preparar p-nitrofenol (pNP) 0,04 g/L em tampão fosfato 100mM pH 8,0 e fazer as seguintes diluições:

C1 = 0,001g/L (50µL solução estoque + 1950µL de tampão)
C2 = 0,002g/L (100µL solução estoque + 1900µL de tampão)
C3 = 0,004g/L (200µL solução estoque + 1800µL de tampão)
C4 = 0,006g/L (300µL solução estoque + 1700µL de tampão)
C5 = 0,008g/L (400µL solução estoque + 1600µL de tampão)
C6 = 0,01g/L (500µL solução estoque + 1500µL de tampão)

2) Ler a absorbância das amostras em λ = 410nm
Amostras (g/L)
Absorbância
0 (branco)

0,001

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

3) Com os valores obtidos traçar o gráfico Absorbância versus concentração e obter a equação da reta
Y = Bx + A

4) Fazer a reação enzimática à 25ºC

29 mL de tampão fosfato 100mM pH 8,0
1mL de pNPB 15mM em 2propanol (P.M = 209,2)
0,01g de enzima

Em intervalos de tempos retirar amostras e fazer a leitura no espectrofotômetro em λ = 410nm. Com o valor da absorbância obtêm-se a concentração a partir da equação da reta obtida anteriormente. Converter a concentração pra µg/mL

t (min)
Abs
C (g/L)
C (µg/mL)
0 (branco)

1,5

3,0

4,5

6,0

7,5

9,0

10,5

12,0

13,5

5) Com os valores da absorbância, traçar um gráfico Concentração (µg/mL) versus tempo para obter o coeficiente angular da reta

6) Converter o valor do coeficiente angular para µmol pNP / mL.min (Peso molecular do pNP = 139,11 g/mol) e encontrar a atividade enzimática específica (UI / g)

Outra maneira de se calcular a atividade lipolítica:

1) Traçar a curva de calibração do pNP em concentração molar (mol/L) e obter o coeficiente angular (coeficiente de absortividade molar no p-nitrofenol nas condições de estudo)

Amostras (M)
Absorbância
7,188 x 10-6

1,437 x 10-5

2,875 x 10-5

4,313 x 10-5

5,751 x 10-5

7,188 x 10-5

2) Fazer a reação enzimática como descrito na metodologia anterior e em intervalos de tempos retirar