POP Leitor De Elisa

Protocolo para Padronização da Contagem em Leitor de ELISA
Novembro de 2012

1. Objetivo
Padronizar as UFC (unidades formadoras de colônias) em solução salina, através da leitura de D.O.

2. Procedimento

2.1 Protocolo para a montagem de protocolo no software:

A leitura da placa de 96 poços deve ser feita no leitor Power Wave da BioTek, utilizando o protocolo previamente programado no software Gen5. O protocolo para a leitura deve ser programado na seguinte ordem:
Programar a leitura (read): determinar a absorbância em 625 nm.
Programar a agitação (shake): média, durante 30 segundos.
Programar a temperatura (temperature): incubadora off.
As amostras devem ser colocadas em triplicata na placa, seguindo o seguinte layout:

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
Br
Br
Br
M1
M1
M1
M2
M2
M2
M3
M3
M3
B

C

D

E

F

G

H

Onde: Br – branco
M1 – Microrganismo 1
M2 – Microrganismo 2
M3 – Microrganismo 3
No item layout selecionar as amostras (poços) a serem lidos; clicar em Blanke selecionar os poços que vão ser lidos como branco.
No item redução de dados introduzir a fórmula x – branco.
Salvar o protocolo.

Para a leitura, ir à aba arquivo, e selecionar o item novo experimento. Abrir o protocolo salvo. Introduzir a placa no leitor, aguardar a estabilização e realizar a leitura da placa (clicando em read).

2.2 Padronização e contagem

A partir das estrias com colônias isoladas, realizar a turvação em salina (até uma turvação equivalente a escala de Mac Farland)
Adicionar desta solução em cada poço 250µl
Realizar a leitura da placa no leitor de ELISA

Tabela 1: Densidade óptica dos microrganismos

Microrganismo
Comprimento onda
D.O (média) lida
Nº. de células
Candida
530nm

108
E. coli
625 nm
0,074
4,10x107
S. aureus
625 nm
0,069
7,30x107
L. monocytogenes
625 nm
0,056
1,53x108