Metodologia para Enzimas

Páginas: 7 (1628 palavras) Publicado: 4 de fevereiro de 2014


POP - PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRONIZADO
UNESP/FCAV
Folha: 01/01


Emissão: 08/02/2013
Revisão:


ENZIMA PEROXIDASE

OBS: As amostras e os tampões devem ser mantidos em gelo durante todo o processo dos extratos.
Dica: Fazer no mesmo dia PPO e POD. Não se deve congelar extratos.
Tomar 10 gramas da amostra, a qual será adicionado 20 mL de tampão fosfato pH 6,7. Homogeneizar por1 minuto e centrifugar a 10.000 rpm por 10 minutos a 4ºC e utilizar o sobrenadante.
Para a determinação, adicionar em tubos de ensaio: 0,5mL de solução A; 0,5mL de solução B e a quantidade adequada de extrato necessária (é necessário fazer um teste para adicionar a quantidade correta de extrato). Para o branco adicionar 1 ml do tampão. Aquecer em banho-maria a 30ºC por 5 minutos.Posteriormente,adicionar 2 mL de álcool etílico a 95% para interromper a reação. Agitar os tubos de ensaio e fazer a leitura em espectrofotômetro a 505 nm.
Esta metodologia foi proposta por MATSUNO & URITANI (1972) e modificada por LIMA (1997).
Esta análise é semelhante para alface, abacate, pêssego, lichia, entre outros.

Reagentes:
- Solução A: transferir 2,2 mL de peróxido de hidrogênio (H2O2) paraum balão volumétrico de 10mL e completar o volume com água destilada. Agitar e tomar 0,5 mL e transferir para um balão de 50mL. Completar o volume com tampão fosfato, pH 6,7. Armazenar em frasco escuro e conservar em geladeira.

- Solução B: dissolver 0,163 g de fenol em mais ou menos 30 mL de água destilada em um béquer. Dissolver 0,0813g de aminoantipirina em mais ou menos 10 mL de águadestilada em um béquer. Misturar estas soluções e completar o volume para 100 mL com água destilada. Armazenar em frasco escuro e conservar em geladeira.

- Tampão fosfato pH 6,7 0,2M: pesar 27,2g de potássio fosfato monobásico (KH2PO4) pH 5, que serão dissolvidos com água destilada e transferidos para balão (1000 mL) e completar o volume. Pesar 34,8g de potássio fosfato bibásico (K2HPO4) pH 9 edissolver em água destilada, transfer para balão (1000 mL) e completar o volume. Em um béquer de 2000 mL colocar a solução de KH2PO4 e acertar o pH para 6,7 com a solução de K2HPO4, com auxílio do peagômetro. Se o pH ultrapassar 6,7 ele é ajustado com ácido acético (CH3COOH) e se não atingir 6,7 é ajustado com NaOH a 1N.

Cálculo:
POD= (leitura x 2)/ (6,58 x 5 x vol. Extrato) = Y

Cálculo final= Y/ ajuste do peso

Cálculo ajuste do peso = peso da amostra x vol.extrato/ 20 mL do tampão








POP - PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRONIZADO
UNESP/FCAV
Folha: 01/01


Emissão: 08/02/2013
Revisão:


ENZIMA POLIFENOLOXIDASE


OBS: Utiliza-se o mesmo extrato preparado para a determinação da atividade da enzima peroxidase.
Tomar 10 gramas da amostra, a qual será adicionado20 mL de tampão fosfato pH 6,7. Homogeneizar por 1 minuto e centrifugar a 10.000 rpm por 10 minutos a 4ºC e utilizar o sobrenadante.
Para a determinação, adicionar em tubos de ensaio: 0,5mL de solução B e a quantidade adequada de extrato necessária (é necessário fazer um teste para adicionar a quantidade correta de extrato). Para o branco adicionar 1 ml do tampão. Aquecer em banho-maria a 30ºCpor 5 minutos. Posteriormente, adicionar 2 mL de álcool etílico a 95% para 420 nm.
Esta metodologia foi proposta por Allain et al (1974).

Reagentes:
- Solução B: dissolver 0,163 g de fenol em mais ou menos 30 mL de água destilada em um béquer. Dissolver 0,0813g de aminoantipirina em mais ou menos 10 mL de água destilada em um béquer. Misturar estas soluções e completar o volume para 100 mLcom água destilada. Armazenar em frasco escuro e conservar em geladeira.

- Tampão fosfato pH 6,7 0,2M: pesar 27,2g de potássio fosfato monobásico (KH2PO4) pH 5, que serão dissolvidos com água destilada e transferidos para balão (1000 mL) e completar o volume. Pesar 34,8g de potássio fosfato bibásico (K2HPO4) pH 9 e dissolver em água destilada, transfer para balão (1000 mL) e completar o...
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