Linha de células ovarianas de rato chinês

FIGURA 1: Estratégia de clonagem de cDNA GCR no mamífero pED vector de expressão . ( a) Mapa de pED vetor dicistrónicos , um derivado da PUC 18, contendo o vírus símio 40 ( SV40 ), origem de replicação e elemento potenciador , o promotor principal tardio de adenovírus ( AdMLP ) , o líder tripartido do adenovírus tarde ARNm ( AdTPL ) , um intron híbrido composto da 5’ sítio de splicing do primeiro líder de adenovírus mRNAs atrasados e a união de um sitio 3’ de um gene de imunoglobulina ( IVS ) , um local de clonagem múltipla ( SMC ) , o 5’ não traduzida do vírus encefalomiocardite (EMC -L), uma região de codificação de DHFR murina , o vírus símio 40 sinal tardio de poliadenilação (SV40 -PA) , e gene de resistência à ampicilina para selecção e propagação em E. coli ( AmpR ) [ 26 ] . GCR cDNA foi clonado nos locais Xbal e EcoRI . ( b ) sequência de amino ácido do GCR do cDNA clonado. O péptido de sinal de 19 aminoácidos está sublinhada . Potencial Ligação do carboidrato resíduos de asparagina são mostrados por diamantes . A arginina na posição 495 foi substituída por histidina ( R495H mutação ) ( disponível comercialmente ) .

FIGURA 2: análise de Western da expressão da GCR humana recombinante em células CHO-DXB11 estavelmente transfectadas, após o terceiro rodada de amplificação com 150 nM MTX. (a) Meio condicionado de 5 clones selecionados (C 12, C 20, C 22, C 37 e C 45). (b) os extractos celulares dos clones selecionados e da membrana correspondente corados com Ponceau S após a transferência de proteínas. A proteína total do meio condicionado foi anteriormente concentrada por precipitação com TCA a 10%. GCR humana não glicosilada recombinante de 56 kDa purificada a partir de E. coli foi utilizado como controlo positivo. O meio condicionado e extracto celular de células CHO-DXB11 não transfectadas eram o controlo negativo. Bandas GCR recombinante glicosilada de 59-69 kDa são indicados pelas setas. O volume da amostra aplicada no gel correspondia a o