leishmaniose

Clayson Moura Gomes

Isolamento de amastigostas

1. Sacrificar os camundongos (por decapitação ou deslocamento cervical), retirar as patas infectadas com leishmânia e colocar em álcool 70% (5 a 10 min);

2. Dissecar as patas, utilizando todo material estéril, cortando os dedos e fazendo um corte sobre todo o restante da pata e retirar toda a pele;

3. Adicionar e depois retirar 1 mL de PBS estéril para lavar a pata, e deixar em torno de 500 µLde PBS e macerar com êmbolo com seringa de 3mL (placa de 24 poços);

4. Homogeneizar e transferir para um tubo de 15 mL, e passar no vórtex por 1 minuto;

5. Ressuspender para 10 mL com PBS estéril;

6. Centrifugar por 5 min 10°C vel 1;

7. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 15 mL;

8. Centrifugar velocidade de 3000rpm por 10 min;

9. Adicionar 1 mL de solução de lise de hemácias e deixar por 3 min e completar para 10 mL de PBS;

10. Lavar 2 vezes com PBS estéril em 3000rpm por 10 min*;

11. Ressuspender 100 µL (se necessário completar o volume com PBS 1X);

12. Transferir 100µL para um tubo de 4mL;

13. Adicionar 0,9 mL de Percoll 100X e passar no vórtex por 30 segundos;

14. Sobrepor 1,0 mL de Percoll 40 X ( com algumas leishmanias fazemos 44 X porque separa melhor);

15. Sobrepor 1,0 mL de PBS 1X estéril;

16. Centrifugar em velocidade máxima (9) por 30 minutos em temperatura de 20°C;

17. Coletar o anel entre o percol de 40 e o de 100X;

18. Centrifugar velocidade de 3000rpm por 10 min a 10°C;**

19. Contar as leishmanias em câmara de neubauer;

20. Separar 6x 105 células (PBMC) para cultura

21. Pegar a placa de 24 poços da estufa e colocar 1x106 de leishmânias em todos os poços;

22. Colocar 5μL de antibiótico em todos os poços para evitar contaminação

23. Colocar a placa na estufa de CO2 a 36°C por 24 horas.

OBS:
A velocidade 1 corresponde a aproximadamente 50g, a velocidade de 3000rpm é 1000g e a velocidade 9 é aproximadamente 1200g.

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