Hibridização in Situ por Fluorescência

Páginas: 5 (1136 palavras) Publicado: 25 de setembro de 2014
Hibridização in situ por fluorescência

O QUE É?
Hibridização in situ por fluorescência ou simplesmente FISH é um método utilizado para identificar partes especificas de um cromossomo. Por exemplo, se você conhece uma sequência de certo gene, mas não sabe em qual cromossomo o gene está localizado, você pode usar FISH para identificar o cromossomo em questão e a exata localização do gene.COMO FUNCIONA?
A técnica envolve a preparação de pequenas sequências fita simples de DNA, chamadas sondas, que são complementares à sequência de DNA que os pesquisadores desejam marcar e examinar. Essas sondas hibridizam, ou ligam, à fita complementar e, como elas são marcadas com marcadores fluorescentes, permitem que os pesquisadores vejam a localidade daquelas sequências de DNA.
A técnica deFISH se resume na utilização de sondas para detecção de sequencias especificas de DNA ou RNA diretamente nos cromossomos de células previamente isoladas para este fim.
Imagem: Aqui na imagem ó, a sonda ira se hibridizar a fita de DNA e ira marcar no cromossomo o local que eles queriam.
COMO SURGIU?
Em 1969 os cientistas Joseph Gall e Mary Lou Pardue desenvolveram a primeira técnica deHibridização in situ onde utilizavam radioisótopos, porem essa técnica exigia muito trabalho, era um processo longo e lento, havendo também limitações na resolução da imagem.
Assim em 1997 surgiu a primeira técnica de FISH utilizando marcadores fluorescentes no lugar de radioisótopos, o que proporcionou um aumento significativo na resolução, rapidez e segurança da técnica.
Mais tarde vieram as sondasCromossômicas, Centromericas e Teloméricas e sondas de sequencia única.

VANTAGENS/APLICAÇOES:
A FISH pode ser aplicada tanto em células em metáfase, pró-metáfase e interfase o que permite fazer diagnósticos citogenéticos mais acurados, tanto para anormalidades constitucionais quantos para mudanças cromossômicas adquiridas, como no caso das células cancerosas. Ela é também um instrumento valioso parao mapeamento gênico.
Ela é aplicada na Detecção de aneuploidias que são anomalias cromossômicas, no Diagnostico de pré-implantação, que é a fertilização in vitru, onde é possível escolher o sexo da criança, ou saber se ela tem alguma alteração cromossômica ou genica, Nas síndromes de Microdeleçoes, que é a perda de uma pequena parte do DNA do cromossomo, em síndromes como a Síndrome deWilliams que é a deleção de gene da elastina e síndrome de Algelman. E nas Leucemias onde é possível saber a avaliação da origem clonal, a caracterização das alterações cromossômicas e estruturais, o diagnóstico, prognóstico e o tratamento. Pode identificar recaída da doença. E o monitoramento pós-transplante
Final: A técnica de FISH torna a confirmação do diagnóstico clínico destas doenças,mais acurada e rápida.
FASES DA FISH
01 Preparação dos Cromossomos: Nessa fase um inibidor mitótico denominado de colcemide segura a célula em metáfase, uma longa exposição a essa substância resulta em maior número de divisões em metáfase às custas do alongamento dos cromossomos. As boas preparações são as que contêm ao menos três divisões em metáfase. Isso pode ser obtido por repetidas fixações elavagens, se necessárias, e diluição apropriada da suspensão.
02 Produção de Laminas: Nesta fase laminas com três dias do procedimento realizado mostram ótimos resultados. Essas laminas devem ser estocadas a – 20 °C. Algum resultado ainda pode ser obtido com laminas estocadas a – 70°C.
03 Preparação da Sondas: São geralmente preparadas por tranlação Nick que dará a sonda o tamanho desejado, quedeve ser de 150 a 300 nucleotídeos. Embora a técnica de PCR também possa ser usada efetivamente. Após isso as sondas são colocadas em microtubulos e estocadas de -15 a -25° C e devem ser descongeladas e pré aquecidas em 37 a 42 °C antes da hibridização.
04 Desnaturação dos Cromossomos: Nesta fase o DNA é desnaturado em 60 a 85 °C EM SOLUÇAO DE FORMAMIDA. O processo termina colocando as...
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