graduando

INTRODUÇÃO

PRÁTICA (01)
OBJETIVOS:
Produção da enzima invertase de Saccharomyces cerevisiae utilizando diferente fonte de carbono.

MATERIAL

- Microrganismo Saccharomyces cerevisiae

- Meios de cultura Caldo Nutritivo modificado

- Equipamentos: Espectrofotômetro Mesa agitadora Balança semi-analítica

- Diversos: Cubetas do espectrofotômetro Tubos de ensaio estéreis 3 Erlenmeyers, 1000ml Pipetas, 1ml e 10ml MÉTODOS
1) Produção da invertase

1. Preparar 1,5 litros de caldo Nutritivo, distribuir 500ml em 3 Erlenmeyers de 1000ml de capacidade. Adicionar no primeiro 10g de glicose, no segundo 10g de sacarose e no terceiro 10g de frutose, homogeneizar e esterilizar a 121oC por 15 minutos. Deixar esfriar;

2. Colocar os Erlenmeyers na balança semi-analítica e inocular esterilmente cerca de 1,0 – 5,0g do microrganismo Saccharomyces cerevisiae (fermento liofilizado) e incubar a temperatura ambiente sob agitação;

3. Centrifugar o caldo fermentado a 10000 rpm por 10 min.

4. Remover o sobrenandante, caldo fermentado contendo a enzima invertase, para um Erlenmeyers estéril e conservá-lo sob refrigeração.

PRÁTICA 2
OBJETIVO
Determinar a atividade da invertase variando a Temperatura e pH

MATERIAL

- Enzima
Invertase obtida das fermentações anteriores

- Equipamentos: Espectrofotômetro Mesa agitadora Balança semi-analítica

- Diversos: Cubetas do espectrofotômetro Tubos de ensaio estéreis Erlenmeyers Pipetas, 1ml e 10ml

MÉTODOS

2. Atividade enzimática1

No reator adicionar 9,0 mL da solução de sacarose a 0,06 M, diluída em tampão fosfato de sódio 0,05 M a pH 5,2, e 1,0 mL da amostra convenientemente (mosto filtrado obtido no item anterior). As reações serão realizadas a 50oC. E a amostra retirada após um tempo de 10 minutos de reação. Com o auxílio de uma curva de calibração previamente determinada pelo método de DNS (anexo 1) pode-se