extração dna graos

Páginas: 2 (318 palavras) Publicado: 2 de outubro de 2014
Universidade Federal de Santa Catarina –


AULA PRÁTICA 1 - EXTRAÇÃO DNA
ISOLAMENTO DE DNA DE GRÃOS E FARINHAS
(MÉTODO CTAB MODIFICADO PARA ANÁLISE DE AMOSTRAS DE OGM)
1.Pesar 1 Kg de grãos;
2. Moer os grãos em moinho analítico e colher duas sub-amostras 100 mg de farinha em
tubo de microcentrífuga de 2 mL;
3. Acrescentar 800 µL de tampão CTAB (CTAB20 g/L, 1.4 M NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH
8, 20 mM EDTA) e homogeneizar em vortex por 1 min;
4. Adicionar 20 µL de proteinase K (20mg/ ml) e homogeneizar manualmente
suavemente.
5.Incubar a 65ºC por 15 min;
6. Adicionar 20 µL de RNAse A (10 mg/mL) e homogeneizar manualmente suavemente.
7. Incubar a 65ºC por 10 min;
8. Adicionar 520 µL clorofórmio
9.Agitar em um Vortex durante 1 min;
10. Centrifugar 13.000 rpm por 10 min;
11. Transferir o sobrenadante (~500 µL) para um novo tubo (1,5 mL) e acrescentar igual
volume (~500 µL) declorofórmio
12. Agitar em um Vortex durante 1 min;
13. Centrifugar 13.000 rpm por 10 min;
14. Transferir o sobrenadante (~500 µL) para um novo tubo (1,5 mL) e acrescentar igualvolume (~500 µL) de isopropanol e ½ V (~250 µL) de acetato de amônio 7,5 M;
15. Centrifugar 13.000 rpm por 10 min;
16. Retirar o sobrenadante e lavar o precipitado com ~500 µL deetanol 70%;
17. Centrifugar 13.000 rpm por 5 min;
18. Retirar o sobrenadante e secar o precipitado em temperatura ambiente durante 15 min;
19. Solubilizar o precipitado em 50 µL deágua ultra-pura. Deixar a 4°C overnight
20. Determinar a concentração e qualidade do DNA em espectrofotômetro UV/Vis a 260
nm e 280 nm
21. Armazenar a solução de DNA a -20ºC.
TAMPÃOCTAB
P/ 100 mL
pesar:
100 mM Tris pH 8,0------------1,21g
1,4 M NaCl----------------------8,18g
20 mM EDTA-------------------0,74g
2% CTAB-----------------------2,0g

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