Enzimas de Restrição

Quando enzimas de restrição cortam onde não devem

Laboratório de biologia molecular que se preze tem pelo menos meia dúzia de enzimas de restrição no freezer. Elas cortam o DNA, não em pontos aleatórios, mas em sequências específicas, os sítios de restrição. Um grande número destas enzimas já foi identificado e está disponível comercialmente. Cada uma delas reconhece e corta um sítio de restrição diferente. E é justamente por isso que elas são tão úteis. Não importa qual seja a sua aplicação - cortar um plasmídio e/ou gene para clonagem ou a análise do padrão de fragmentos de um genoma – a especificidade destas enzimas é sempre essencial para o sucesso do experimento.

Mas, como nem tudo é perfeito, em algumas condições estas enzimas podem cortar o DNA onde não devem, ou seja, em sequências diferentes do seu sítio de restrição. O nome deste fenômeno é “atividade estrela” (star activity) e acontece quando a reação de digestão do DNA não segue as condições consideradas ótimas para o funcionamento da enzima. Em geral, você estará seguro se seguir o protocolo do fabricante, mas veja abaixo alguns cuidados para evitar este problema, principalmente, ao modificar o volume de reação.

Quantidade de enzima por reação.
Não deve ultrapassar 10% do volume final da reação. A enzima vem em uma solução que contem 50% de glicerol. E mais de 5% de glicerol na reação irá causar atividade estrela. Também é importante respeitar a quantidade de enzima (unidades) por quantidade (ug) de DNA recomendada pelo fabricante.

Tampão.
Use sempre o tampão recomendado, na diluição indicada. Em geral, cada enzima tem um tampão ótimo. E, a não ser que tenham composições iguais, o tampão de uma, não pode ser usado com outras enzimas.

Tempo de digestão.
Eu sei o quanto as incubações “overnight” (de um dia para o outro) são legais e práticas. Mas, por mais que o fabricante diga que a digestão pode levar de 2 a 18 horas, use sempre o tempo mínimo, ou algo mais próximo dele.