Eletroforese

Eletroforese

Eletroforese –para separar e às vezes purificar macromoléculas – proteínas e ácidos nucléicos – diferentes tamanhos, carga ou conformação

Quando moléculas são colocadas em um campo elétrico, migram para o pólo positivo ou negativo. Proteínas (carga líquida negativa ou positiva) e DNA sempre negativa (fosfato)

Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel O gel é submerso em um tampão que possui íons para a corrente passar E também para manter o pH mais ou menos constante.

Gel: composto de agarose ou poliacrilamida
Agarose é um polissacarídeo extraído de alga marinha. Usada em concentrações de 0,5 to 2%. Fácil de preparar. Não-tóxico.

Géis de Agarose possuem ampla capacidade de separação mas baixa resolução Dependendo da concentração podem separar fragmentos de DNA de 200 a 50.000 bp, via eletroforese.

Poliacrilamida é um polímero de ligação cruzada de acrilamida. Comprimento das cadeias do polímero dependem da concentração usada (3,5 a 20%). São mais difíceis de preparar. Como oxigênio inibe a polimerização precisam ser montados entre placas de vidro.

Acrilamida: potente neurotóxico e deve ser manipulado com cuidado!!! Luvas e máscaras devem ser usadas para pesar o pó. A poliacrilamida é considerada não tóxica mas luvas devem ser usadas pela possível presença de acrilamida livre

Géis de poliacrilamida possuem baixa capacidade de separação mas alta capacidade de resolução. Para DNA a poliacrilamida é usada para separar fragmentos de menos de 500 bp. Às vezes podem ser separados fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferença. Também usados para separação de proteínas.

Equipamento e reagentes para gel de agarose:
•Uma cuba de eletroforese e um fonte de força •Bandejas de Gel, em diferentes tamanhos de plástico transparente à UV. As extremidades são abertas para montar o gel e depois removidas na eletroforese •Pentes para fazer poços aonde as amostras serão aplicadas •Tampão de eletroforese (corrida),