EFEITO NA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO DA ATIVIDADE DA SACAROSE DE FERMENTO

14.1 Introdução Em uma reação catalisada por uma enzima (com uma concentração fixa de enzima), um aumento na concentração de substrato resultará, inicialmente, em um rápido aumento da velocidade da reação. Entretanto, com o aumento da concentração de substrato o aumento da velocidade de reação começa a diminuir até que, com uma alta concentração de substrato, a velocidade de reação tende a estabilizar-se.
14.2 Objetivos do trabalho prático Determinar o Km e o Vm da sacarase de fermeto utilizando a transformação de Lineweaver – Burk. A determinação é feita fazendo reações de enzimas com varias concentrações de substrato.
14.3 Materiais utilizados - 7 tubos de ensaio - Sacarase - Banho maria - DNS - Água destilada - Espectrofotômetro

14.4 Procedimento
 Preparar um série de 7 tubos de ensaio e adicionar em cada tubo 0,2 ml de sobrenadamente de fermento (sacarose) convenientemente diluído.
 Adicionar mais rápido possível 0,2 ml das seguintes soluções de sacarose preparada em tampão acetato 0,25 M pH 4,7: 0,02 M; 0,03
M; 0,04 M; 0,05 M; 0,06 M; 0,08 M; e 0,10 M.
 Incubar os tubos em banho-maria a 30ºC durante 20 minutos.
 Interromper a reação adicionando 0,4 mL de DNS.
 Colocar os tubos simultaneamente em água em ebulição durante exatamente 5 minutos.
 Retirar simultaneamente todos os tubos de ebulição, esfriar e adicionar 1,0 mL de água destilada.
 Fazer a leitura da transmitância a 550 nanômetros (nm), zerando o espectrofotômetro com o tubo branco.
14.5 Tabela e resultados Tubos Enzimas (ml) Substrato[S] [M] ml Tempo min DNS ml E R Absorbância ABS/10min
1 0,2 ml 0,2ml 0,02 10’ 0,4ml B E 0,028
2 0,2 ml 0,2ml 0,03 10’ 0,4ml U S 0,037
3 0,2 ml 0,2ml 0,04 10’ 0,4ml L F 0,041
4 0,2 ml 0,2ml 0,05 10’ 0,4ml I R 0,052
5 0,2 ml 0,2ml 0,06 10’ 0,4ml Ç I 0,063
6 0,2 ml 0,2ml 0,08 10’ 0,4ml à A 0,070
7 0,2 ml 0,2ml 0,10 10’ 0,4ml o R 0,082
B 0,4ml -