Citogenética

DETECÇÃO DOS SÍTIOS DE HIBRIDIZAÇÃO

Na marcação indireta, após a hibridização, a sonda precisa ser detectada, o que é feito por meio de moléculas conjugadas, constituídas por uma unidade capaz de reconhecer e se ligar fortemente à molécula marcadora da sonda e outra que permite sua visualização ao microscópio (sinalização).
A unidade que reconhece a marcação da sonda é geralmente um anticorpo ou outra molécula com alta capacidade de associação com a molécula marcadora.
Se a sonda for marcada com biotina, poderá ser localizada com um anticorpo antibiotina ou com avidina ou estreptavidina. Se for marcada com digoxigenina usa- se antidigoxigenina.
A avidina é uma glicoproteína extraída do ovo de galinha (como a biotina), com uma constante de associação pela biotina 1.000.000 vezes mais alta que a afinidade típica de antígenos-anticorpos. A avidina pode ser substituída pela estreptavidina, uma glicoproteína secretada pelo fungo Streptomyces avidini composta por quatro subunidades, cada uma com um sítio de ligação com uma biotina. A estreptavidina tem a vantagem de ser mais específica que a avidina, embora apresente menor estabilidade e constante de associação mais baixa.
O anticorpo, ou a avidina/estreptavidina, precisa estar previamente ligado a uma molécula sinalizadora, que é a unidade do conjugado que permite sua visualização ao microscópio.A molécula sinalizadora pode ser uma enzima ou um fluorocromo.
As principais moléculas adicionadas às sondas são: biotina e digoxigenina e são reconhecidas por antibiotina, avidina, estreptavidina ou antidigoxigenina e as sinalizadoras são as enzimas fosfatase alcalina ou fluorocromos ( rodamina ou FITC).

ENZIMAS UTILIZADAS NA DETECÇÃO DOS SÍTIOS DE HIS

As enzimas mais comumentes utilizadas nesse processo são a fosfatase alcalina e uma peroxidase obtida da planta Armoracia rusticana (em inglês, horseradish). Essas enzimas são geralmente biotiniladas, permitindo que se liguem à