Bioquimica

Aula Prática 5: Contagem de células de leveduras em câmara de Neubauer
Uma das formas mais comuns de se determinar a viabilidade de células de levedura é através do uso da câmara de Neubauer, também conhecida como hemacitômetro.

A câmara de Neubauer consiste de uma lâmina de microscopia, bem mais alta do que uma lâmina normal, com marcações em quadrantes, de medidas conhecidas. Observando-se ao microscópio, percebe-se que existem três tipos de quadrantes denominados A, B e C, que juntos formam um quadrado maior.

Pode-se notar que estes quadrantes têm sub-divisões diferentes, fazendo com que o critério para escolha do quadrante onde serão contados as células, seja o tamanho dos células a serem quantificados. Assim, usualmente, células muito pequenas são contados no quadrante C, as de tamanho intermediário no quadrante B, enquanto células grandes são contados no quadrante A. A área total compreendida pelos 9 quadrantes é de 9 mm2 sendo que cada quadrante (A, B e C) são quadrados de 1 x 1 mm. Ao ser colocada a lamínula (especial para ser usada na câmara de Neubauer) a distância da lamínula até a lâmina (profundidade) mede 0,1 mm, o que permite se obter um volume de 0,1 mm3 em cada quadrante.

A técnica de coloração consiste em se misturar partes iguais da suspensão de levedura (amostra), adequadamente diluída, e da solução corante (azul de metileno ou eritrosina). As células com alta atividade fisiológica não se colorem, enquanto as células inativas (mortas) apresentar-se-ão coloridas de azul (azul de metileno) ou rosa (eritrosina). A porcentagem ou o número de células viáveis é determinado transferindo-se com uma pipeta de Pasteur a amostra para a câmara de Neubauer. Trata-se de uma lâmina especial, precisamente dividida em quadrados de 1 mm2 de área; a lâmina é coberta com uma lamínula,que deixa um volume, sobre cada quadrado, de 10-4 cm3 ou 0,1 mm3 .
0.1 mm3 – 0.0001 cm3 – 0.0001 mL ou 10-4 mL
Procedimento
1- Transferir 1 mL para um tubo de