bacteria

Para a identificação das bactérias associadas capazes de degradar os diferentes tipos de substratos foi realizado o sequenciamento da região conservada 16S rRNA. O gene 16s rRNA foi amplificado através do método de PCR de colônia, sendo utilizados os primers 27F - 5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3' (GIOVANNONI, 1991) e 1500R - 5'GGTTACCTTGTTACGACTT 3' (LANE, 1991), amplificando uma região de aproximadamente 1,5 kb. Este procedimento foi realizado no termociclador MJ Research PTC 100 Thermal Cycler seguindo o seguinte programa: 1 ciclo a 94 ºC por 5 minutos; 35 ciclos (94 ºC, 1 minuto; 50 ºC, 1 minuto; 72 ºC, 2 minutos) seguidos de um ciclo de extensão final de 72 ºC por 20 minutos.
O produto de amplificação foi então submetido à eletroforese em gel de agarose 1 % corado com brometo de etídeo (0,02 μg.μl-1). A corrida eletroforética foi conduzida em tampão TAQ com KCl 1x (10 mM Tris-HCl e 50mM KCl) a 90V. O gel foi posteriormente visualizado em luz UV para comprovar a amplificação dos fragmentos. As bandas do produto amplificado com o tamanho esperado (1,5 kb) foram cortadas do gel com o auxílio de um bisturi e colocadas em tubos de 1,5 ml. O produto de PCR de colônia amplificado foi purificado utilizando o kit Wizard® SV Geland PCR Clean-Up System (Promega, Madison, WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante e depois quantificado em leitura no espectrofotômetro NanoDrop ND 1000 (Thermo Scientific, CA, EUA). O produto purificado de PCR foi seqüenciado em um MegaBACE 1000 Flexible kit usando o kit DYEnamic ET Dye terminator (GE Healthcare) segundo as instruções do fabricante. As reações de PCR para o sequenciamento foram realizadas utilizando o oligonucleotídeo iniciador 338F (5’ ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3’) (LANE, 1991), que corresponde a região hipervariável V3 do 16S rRNA.
A análise das sequências foi realizada pelo software Base Caller Cimarron 3.12. Regiões de baixa qualidade foram retiradas usando o programa DCAS (GUO et al., 2009) (Phred-Prap