Azul de metinelo

Ciclo de Krebs - Cadeia Respiratória
Inibição Competitiva
I - Introdução:
O objetivo desta aula é demonstrar a atividade de enzimas desidrogenases usando dois corantes, azul de metileno (MB) e cloreto de trifeniltetrazólio ( TTC ), como aceptores de elétrons. Certos corantes, como o MB, são coloridos na forma oxidada ( MB+ ) e incolores na forma reduzida ( MBH ). Estes corantes reagem prontamente com sistemas biológicos de oxidação-redução e a velocidade de reação pode ser acompanhada pelo desaparecimento da cor da forma oxidada. Diferente do MB, TTC é incolor quando oxidado e forma um composto vermelho quando reduzido.
II - Materiais:
- KCl 1,1%
- succinato 0,1 M pH 7,4
- azul de metileno 0,002%
- tampão fosfato 0,1 M pH 7,4
- cloreto de trifeniltetrazólio 0,5%
- óleo mineral
- malonato 0,2 M pH 7,4
III. Isolamento de mitocôndrias:
1. Coração (C) e fígado (F) de avícolas são mantidos num béquer com KCl 1,1% em banho de gelo.
2. Pesar o coração e o fígado. Colocar num tubo com KCl 1,1% na proporção de 10 ml para cada 1 g.
3. Homogeneizar em aparelho homogeneizador, tipo van Potter.
4. Centrifugar a 4ºC, 3000 rpm por 10 min. Coletar o sobrenadante.
5. Centrifugar o sobrenadante a 4ºC, 22000 rpm por 10 min.
6. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado num volume de tampão fosfato correspondente ao peso do tecido. Manter em banho de gelo.
IV. Caracterização e Inibição da enzima succinato desidrogenase: 1
C 1
F 2
C 2
F 3
C 3
F 4
C 4
F 5
C 5
F 6
C 6
F 7
C 7
F 8
C 8
F 9
C 9
F 10
C 10
F
mitocôndria de coração/fígado (mL) --- --- 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Succinato (mL) 0,20 0,20 --- --- 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
Malonato (mL) --- --- --- --- --- --- 0,20 0,048 0,20 0,048 azul de metileno (mL) 0,20 --- 0,20 --- 0,20 --- 0,20 0,20 --- ---
TTC (mL) --- 0,10 --- 0,10 --- 0,10 --- --- 0,10 0,10 água destilada (mL) 0,40 0,50 0,40 0,50 0,20 0,30 --- 0,152 0,10 0,252 óleo mineral (mL) 0,40 --- 0,40 ---