Westhern blot

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Western blot

Um Western blot é um método em biologia molecular e bioquímica para detectar proteínas em um homogenato (células bem trituradas) ou um extrato de um tecido biológico. Essa técnica usa eletroforese em gel para separar as proteínas desnaturadas por massa. As proteínas são então transferidas do gel para uma membrana (tipicamente de nitrocelulose), onde foram usados como sondaanticorpos específicos à proteína. Como um resultado, os pesquisadores podem examinar a quantidade de proteína em uma dada amostra e comparar os níveis entre diversos grupos.
O nome Western blot é um trocadilho do nome Southern blot, uma técnica para detecção de DNA desenvolvida anteriormente por Edwin Southern. Também há uma técnica chamada

Northern blot que serve para a detecção de RNA.
Método deexecução do Western blot
Preparação do tecido
Tipicamente, amostras podem ser tomadas, tanto de um tecido biológico quanto de uma cultura de células. As amostras são resfriadas ou aquecidas rapidamente. Elas são homogenizadas por sonicação (quebra das células por ondas sonoras de alta freqüência) ou por força mecânica. O resultante é a mistura homogênea dos componentes da célula, e pode serusado da forma que está ou sujeita a centrifugação em uma série de passos para se isolar as frações do material citosóico (material do interior da célula externo ao seu núcleo) e nuclear. Na amostra preparada é então quantificada, para que uma quantidade consistente de proteína possa ser retirada de cada amostra diferente.
As amostras são fervidas de um a cinco minutos em uma solução tampão,contendo corante, um composto sulfuroso e um detergente conhecido como dodecil sulfato de sódio (SDS). A ebulinação e o detergente desnaturam a proteína, desenovelando-a completamente. O SDS então cerca a proteína, deixando-a coberta por uma carga negativa, e o enxofre impede a formação de pontes de dissulfeto na proteína.
Eletroforese em gel
As proteínas da amostra são separadas de acordo com o pesomolecular usando-se a eletroforese em gel. Géis têm várias formulações dependendo do laboratório, peso molecular das proteínas de interesse e tampões disponíveis, os géis de poliacrilamida são os mais comuns. Desde que as proteínas caminham apenas em uma direção ao longo do gel, as amostras são carregadas lado-a-lado em "valas" feitas no gel. As proteínas são então separadas por massa em "bandas"dentro de cada canaleta. Uma canaleta é reservada para um "marcador", ou ladder, uma mistura disponível comercialmente de proteínas de pesos moleculares conhecidos.
Também é possível usar um gel 2-D que separa as proteínas de uma única amostra em duas dimensões e as proteínas são separadas na primeira dimensão de acordo com o ponto isoelétrico (pH no qual elas têm uma carga total igual a zero), ena segunda de acordo com seus pesos moleculares.
Transferência
A fim de fazer as proteínas acessíveis à detecção do anticorpo, elas são movidas do gel para uma membrana de nitrocelulose ou de PVDF. A membrana é colocada face-a-face com o gel, e uma corrente elétrica é aplicada entre grandes placas de cada lado, então as proteínas carregadas se movem do gel para a membrana enquanto mantém amesma disposição que continham no gel. Como resultado desse processo de "borramento" (blotting em Inglês), as proteínas são expostas a uma fina camada para detecção (veja abaixo). Ambas as variedades de membranas são escolhidas por suas propriedades de ligar proteínas não especificamente (isto é, liga todas as proteínas igualmente bem). A ligação das proteínas à membrana é baseada tanto em interaçõeshidrofóbicas quanto em interações de cargas entre a membrana e as proteínas. As membranas de nitrocelulose são mais baratas que as de PVDF, porém são mais frágeis e não suportam bem a repetidas amostragens.
Bloqueio
Desde que a membrana foi escolhida por sua habilidade de ligar proteínas, passos precisam ser feitos para impedir as interações não específicas entre a membrana e o anticorpo usado...
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