Tecnologia da biologia celular e molecular

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1. Introdução


A biologia celular e molecular estuda objetos muito pequenos, por isso depende inteiramente do aperfeiçoamento dos instrumentos e das técnicas de pesquisa.
Os conhecimentos sobre as células progridem paralelamente ao aperfeiçoamento dos métodos de investigação. Inicialmente, o microscópio óptico, também chamado microscópio de luz, possibilitou o descobrimentodas células e a elaboração da teoria de que todos os seres vivos são constituídos por células.
Posteriormente, foram descobertas técnicas citoquimicas que possibilitaram a identificação e localização de diversas moléculas constituintes das células, com o advento dos microscópios eletrônicos que tem grande poder de resolução, foram observados em maiores detalhes a estrutura celular que nãopoderiam ser vistos pelos microscópios ópticos. Mais ou menos simultaneamente com o uso dos microscópios eletrônicos, foram aperfeiçoados métodos para a separação de organelas celulares para o estudo in vitro de suas moléculas e respectivas funções.



































2. Confecção de cortes para estudo nos microscópios óptico e eletrônico.Muitas vezes há vantagem em obter um preparado permanente (lâmina), no qual as células ficam fixadas e coradas, para melhor demonstração dos seus componentes.
Um preparado ideal deveria mostrar as células com a mesma estrutura microscópica e composição química que possuíam quando vivas, mas isso não é possível, e todos os preparados apresentam artefatos (alterações produzidas nascélulas pelas técnicas utilizadas).
Fixação é a primeira fase para obter um preparado permanente e tem as seguintes finalidades:
- evitar a autólise ( destruição da célula por suas próprias enzimas);
- impedir a atividade e proliferação de bactérias;
- endurecer as células para que elas resistam melhor às etapas seguintes;
- aumentar a afinidade das estruturascelulares pelos corantes usados na microscopia óptica e o contraste na microscopia eletrônica.
A fixação é complexa e pouco conhecida. O formol e o aldeído glutárico (possui um grupamento aldeídico em cada extremidade de sua molécula) fixam as células.
O tetróxidode ósmio e o glutaraldeído são fixadores mais usados em microscopia eletrônica por coagularem as proteínas, causandomodificações mínimas. Por isso, foram elaboradas as misturas fixadoras, que contêm proporções variáveis dos fixadores simples, com finalidade de compersar-lhes as deficiências.
Microtomia: na maioria, as células fazem parte de tecidos que precisam ser cortados em fatias finas para exame no microscópio, nos quais são feitos em um aparelho chamado micrótomo, onde o fragmento de tecido fixado é geralmenteprotegido por um material que o envolve e nele penetra, devendo possuir propriedades que facilitem o corte. Estes tecidos são estudados no microscópio óptico e incluídos em parafina ou resinas plásticas especiais, sendo cortados numa espessura de 1 a 6 micrômetros, utilizando navalhas de aço. No microscópio eletrônico, os tecidos devem ser incluídos em resinas mais duras, como as do tipo epóxi,onde os cortes são muito finos, medindo 0,02 a 0,1 e usando navalhas de vidro ou diamante.
Coloração: quase todas as organelas são transparentes e incolores, por isso foram criados numerosos processos de coloração que tornam visíveis os componentes celulares. A maioria dos corantes comporta-se como base (grupamento responsável pela cor é catiônico) ou ácido. Os cromóforos desses corantescombinam-se com os grupamentos ácidos, sendo assim, as moléculas ácidas, como as do DNA e RNA são basófilas (têm afinidade pelos corantes básicos). Ex. de corantes básicos: azul de metileno e azul de toluidina. A hematoxilina (corante muito usado) comporta-se como corante básico, ligando-se às estruturas basófilas dos tecidos.
Nos corantes ácidos, o cromóforo é aniônico (carga elétrica...
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