Tecnicas de analise de dna

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Faculdade de Medicina da Universidade do Porto,
Departamento de Biologia Celular e Molecular




Técnicas de análise de DNA
aplicadas a diagnóstico






Porto, 18 de Abril de 2005
Ana Carrapa, turma 3
Ana Zão, turma 3
Joana Coelho, turma9
João Santos, turma 9
Sara Pedrosa, turma 9
Introdução
A história da genética médica foi revolucionada pelo trabalho de Watson e Crick, em 1953, onde foi proposta a estrutura de dupla hélice de DNA. Durante os últimos 20 anos a tecnologia do DNA recombinante tem vindo a desenvolver técnicas muitopoderosas e sensíveis que são usadas no estudo e na identificação de anomalias moleculares.
O objectivo deste trabalho é abordar algumas dessas técnicas de análise de DNA, nomeadamente: “Polymerase Chain Reaction” (PCR), “Denaturing Gradient Gel Electrophoresis” (DGGE), “Restriction Fragment Length Polymorfism” (RFLP), Hibridação in situ e “Variable Numbers of Tadem Repeats” (VNTR), que permitam,de certa forma, a identificação de genes relacionados com doenças genéticas específicas, abrindo a possibilidade de diagnóstico.

As principais áreas de aplicação destas técnicas moleculares de diagnóstico reflectem-se ao nível das doenças infecciosas, do cancro, das doenças genéticas, dos transplantes e da patologia clínica.



Técnicas de análise de DNA
PCR
O que é a PCR?A PCR (Reacção de Polimerização em Cadeia) é uma metodologia que se baseia na amplificação exponencial selectiva de uma quantidade reduzida de DNA de uma única célula. Esta técnica revolucionou o mundo científico e as suas aplicações são imensas: é usada no diagnóstico médico, mapeamento genético, detecção de doenças hereditárias, clonagem de genes, testes de paternidade, identificação de“impressões digitais” genéticas… De facto, a PCR revolucionou várias áreas como a Biologia Molecular, Patologia, Farmácia, Botânica, Medicina Forense e valeu o prémio Nobel, em 1993, a Kary Mullis.
Objectivo
O objectivo da PCR é produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico de DNA a partir de uma quantidade mínima. O DNA molde sofre uma amplificação controlada por enzimas,obtendo-se milhões de cópias do fragmento de DNA de interesse. O molde pode ser qualquer forma de DNA de cadeia dupla, como o DNA genómico: pode usar-se uma gota de sangue, um fio de cabelo, uma célula do epitélio oral, um blastómero…
Em que consiste um ciclo de PCR?
Um ciclo de PCR (Fig.1) consiste em três fases: desnaturação do DNA molde (a 95ºC), ligação (“annealing”) dos primers (a 64ºC)e polimerização do DNA (a 72ºC). Na 1ª etapa faz-se a separação das cadeias de dupla hélice de DNA através do calor. Esta separação é essencial para que, na 2ª fase, dois primers de oligonucleótidos se liguem às sequências dos pares de bases complementares da cadeia molde. Estes primers são desenhados e sintetizados de modo a ligarem-se às extremidades opostas de cada uma das cadeias de DNA moldeque se pretende amplificar. Os primers servem, portanto, de ponto de partida para a replicação de DNA e, na última etapa, faz-se a sua extensão. A enzima responsável por esta polimerização é a DNA polimerase termo-estável (Taq), tendo sido isolada a partir da bactéria termofílica Thermus aquaticus que vive em elevadas temperaturas. É essencial que a enzima usada seja estável ao calor, uma vez queos ciclos de PCR têm lugar a temperaturas situadas entre os 64ºC e 95ºC. Para executar este ciclo usa-se um termociclador, que faz variar de forma rigorosa o tempo e a temperatura ao longo do ciclo. Normalmente são repetidos cerca de 30 ciclos, o que demora apenas algumas horas.
Assim, duas novas cadeias são sintetizadas a partir da cadeia molde em cada ciclo completo de PCR logo dá-se um...
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