Tecnicas cromatografia

AULA PRATICA 2: Técnicas cromatográficas:

1. CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR OU GEL-FILTRAÇÃO:

a. coluna empacotada com a resina Sephacryl S-200 (matriz de poliacrilamida; faixa de resolução entre 10.000 e 200.000 para proteinas). Resina equilibrada em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7.5.

b. amostra: 200 ul hemoglobina A (66.000 d) a 50 mg/ml, 100 ul azul de dextrana (2.000.000 d) a 20 mg/ml e 50 ul de vitamina B12 (1.200 d) ou DNP-aminoácido ou ácido pícrico 0.1%. O volume da amostra não deve exceder 1% do volume da resina.

c. Procedimento: aplicar a amostra no topo da coluna (retirar excesso de tampão) e recolher frações de 1-5% do volume total da coluna. Identificar visualmente as substâncias nos tubos recolhidos.

RELATÓRIO - Descreva o que aconteceu neste experimento, fazendo um gráfico com a intensidade de cores obtidas nas várias frações (em cruzes) na ordenada e o volume cumulativo das frações na abcissa. Responda: O que aconteceria se o pH do tampão fosse 5.0 ? Em que ordem seriam eluídas na coluna uma amostra que contivesse citocromo C (13.000 d), azocaseína (45.000 d), hemoglobina (66.000 d), além de azul de dextrana, e vitamina B12 ?

2. CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA:

a. coluna com a resina carboximetil (CM-)celulose, equilibrada em fosfato de sódio 20 mM, pH 6.5.

b. amostras:
(1)- 500 ul azul de bromofenol, 100 mg/ml em água (PI =4.5) e 500 ul hemoglobina A (PI = 7.1) a 20 mg/ml. (2) - idem anterior, acrescentando 100 uo de SDS 10%.

c. Procedimento: Não há necessidade de se controlar o volume da amostra inicial. Aplicar a amostra e retirar da coluna as frações não adsorvidas pela resina, usando o tampão de equilibrio. Quando o efluente ficar incolor, aplicar o tampão de eluição contendo NaCl 1M, para remover a fração retida.

RELATÓRIO - Descreva o que aconteceu no experimento e responda: O que aconteceria se o pH do