Relatório extração de dna

FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS

NÚCLEO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

CURSO DE BIOMEDICINA

PRISCILLA LIMA NÓBREGA
CRISTIANE ALVES
ELIZABETH LUCENA
ERIC D. MARIANO
PATRICIA DA SILVA GOLÇANVES
VERÔNICA LOPES

Análises dos processos referentes à extração de DNA com comparação dos protocolos com clorofórmio e sem clorofórmio

São Paulo, 2012
INTRODUÇÃO

Neste relatórioanalisamos os processos referentes à extração de DNA com comparação dos protocolos com clorofórmio e sem clorofórmio. O primeiro procedimento será a extração do DNA, onde adicionamos ao pellet Buffer A (TRIS 0,01M ph 8,0 / EDTA 0,002 M/ Nacl 0,04 M), cada componente da solução tem uma função especifica. O Tris funciona como solução tampão, estabilizando o PH, O EDTA por sua vez, inibi íons que ativam asDNAses, que degradam o DNA e o NaCl ajuda na precipitação das proteínas e do DNA, processo conhecido como ‘salting in’.
“Em baixas concentrações de sais (baixa força iônica), a solubilidade em geral aumenta, pois os íons salinos tendem a se associar às proteínas contribuindo para uma hidratação e/ou repulsão entre as moléculas, aumentando a solubilidade”. ¹1.http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2004/constituintes_microorg/proteinas.htm
Adicionamos SDS, um detergente anfipático cuja função é desnaturá-las, ou seja, convertê-las numa estrutura linear, a forma nativa é geralmente globular e conferir-lhes densidade de carga uniforme. Em seguida proteinase K, cuja função será degradar todas as proteínas. Depois de um processo de homogeneização e incubação seráadicionado NaCl 5M, onde está concentrado e cuja função será ajudar na precipitação das proteínas e do DNA, processo conhecido por salting out.
“Em elevadas concentrações salinas, os íons competem com a proteína pela água, ocasionando perda de água de hidratação, atração mútua entre as moléculas e formação de precipitado”. ¹1.http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2004/constituintes_microorg/proteinas.htm

Precipitação do DNA
Adicionamos ETOH absoluto gelado ao sobrenadante. O DNA não é solúvel em etanol (álcool etílico). Quando as moléculas são solúveis em um dado solvente, elas se dispersam neste solvente e não são, portanto, visíveis. Por outro lado, quando as moléculas são insolúveis em um dado solvente, elas se agrupam, tornando-se visíveis.
Quantomais gelado estiver o álcool, menos solúvel o DNA vai estar, por isso é tão importante que o etanol seja mantido no freezer ou em um banho de gelo até a hora do experimento.
Lavagem das proteínas
Adicionamos ao sobrenadante Fenol-Clorofórmio: Álcool Isoamílico que será eficiente para desproteinizar e sua ação se fundamentam na propriedade hidrófoba das proteínas que apresentam afinidade porsolventes orgânicos, reduz espuma, deixa parte orgânica mais densa.
Espectrofotometria
Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ou emissão de radiação eletromagnética por muitas moléculas, quando os seus elétrons se movimentam entre níveis energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho. (fig 1)

Fig.1. Espectro eletromagnético. A espectrofotometria utiliza a radiação compreendida entre o ultravioleta (ultraviolet) e o infravermelho (infrared).
A chamada radiação luminosa corresponde a uma gama de comprimentos de onda que vai desde o ultravioleta ao infravermelho no espectro da radiação eletromagnética. (fig. 2)

Fig.2. Radiação luminosa.

Um espectrofotómetro é um aparelho que fazpassar um feixe de luz monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução (Fig. 3). Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda (tal como acontece no arco-íris com a separação das cores da luz branca). Pode-se assim fazer passar através da amostra um feixe de luz monocromática (de um único comprimento de...
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