Quimica

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  • Publicado : 19 de abril de 2012
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INTRODUÇÃO

Os métodos de isolamento e purificação dos ácidos nucleicos consistem de três etapas: (1) lise das células e solubilização do DNA ou RNA; (2) método enzimático ou químico para removeras proteínas contaminantes e outras macromoléculas; e (3) precipitação alcoólica para isolamento do DNA. Os protocolos básicos geralmente são aplicáveis a um ampla variedade de materiais.
O métodobásico compreende a ruptura do tecido com um homogeneizador, a lise celular com o detergente iônico SDS, extração fenólica das proteínas e precipitação etanólica do DNA. Este método é útil para preparaçãode DNA genômico de muitas amostras de tecido ou de linhagens celulares, com um mínimo de consumo de tempo e trabalho. O DNA genômico produzido é adequado para amplificação por PCR ou para a digestãocom enzimas de restrição e análise de transferência de DNA. Uma quantidade substancial de RNA acompanha o DNA genômico, o que dificulta a quantificação por espectroscopia no UV. Algumas amostras deDNA não amplificam bem por PCR ou não são completamente digeridas com enzimas de restrição e devem, portanto, ser reextraida .
O protocolo mais adequado à rotina laboratorial para isolamento de DNA eRNA compreende a lise celular com SDS, remoção das proteínas por precipitação com cloreto de sódio concentrado e isolamento do DNA genômico por precipitação etanólica.

O método mais adequado parapreparar RNA de boa qualidade envolve a solubilização simultânea do tecido ou células e inativação de Rnases endógenas na presença de isotiocianato de guanidina, com subsequente separação do RNA do DNAe das proteínas por ultracentrifugação em gradiente de cloreto de césio. Dois outros métodos que não requerem ultracentrifugação podem se utilizados: (1) lise com detergente não-iônico paraproporcionar um método rápido para preparação de amostras de RNA citoplasmático e (2) lise celular com isotiocianato de guanidina, remoção das proteínas pela extração fenólica em pH ácido, seguida de...
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