Propriedades proteolíticas do extrato enzimático bruto de um rizóbio nativo da amazônia central

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PROGRAMA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA - PIBIC
COORDENAÇÃO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DO SOLO


















PROPRIEDADES PROTEOLÍTICAS DO EXTRATO ENZIMÁTICO BRUTO DE UM RIZÓBIO NATIVO DA AMAZÔNIA CENTRAL






BOLSISTA: Juliete de Souza FigueiredoORIENTADOR: Dr. Arlem Nascimento de Oliveira










Relatório Final apresentado ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia-INPA, como parte das exigências do PIBIC CNPq/INPA/FAPEAM











Manaus – Amazonas
2009

Título do Projeto do Orientador: Produção e Caracterização de Amilases e Proteases de Rizóbios Nativos daAmazônia Central

Título do Plano de Trabalho do Bolsista: Propriedades Proteolíticas do Extrato Enzimático Bruto de um Rizóbio Nativo da Amazônia Central

Resumo

Programas visando selecionar novas fontes microbianas para a produção de enzimas estão crescendo no mundo todo. O complexo nitrogenase presente nas bactérias genericamente conhecidas como rizóbio, é chave na fixação biológica donitrogênio pelas leguminosas e, portanto, o mais bem estudado na área agronômica. Porém, não se deve negligenciar o potencial dessas bactérias em produzir outras enzimas de reconhecido valor biotecnológico, como é o caso das proteases. O presente estudo visou avaliar a produção e caracterizar o extrato enzimático proteolítico de um rizóbio nativo da Amazônia Central. Em 48 de incubação, o rizóbio INPAR-732 apresentou seu maior crescimento, correspondendo a uma densidade óptica de 1,3. Nas condições experimentais estudadas, a maior atividade proteolítica (17 U) também foi anotada em 48 h de incubação, coincidindo com o final da fase exponencial de crescimento microbiano. A atividade enzimática foi crescente até o pH 8,0, onde atingiu seu nível máximo (22 U). Por outro lado, a menor atividadefoi registrado em pH 10,0, que representou 30% da atividade ótima. Quanto à estabilidade, o extrato proteolítico foi 100% estável em pH 7,0, decrescendo significativamente a partir desse valor. Em pH 10,0, o extrato já havia perdido 83% de sua atividade em 24 h. A atividade enzimática aumentou com a elevação da temperatura, atingindo seu máximo valor a 40 ºC (25 U). Em 50 ºC foi registrado umaredução de 62% na atividade, em relação à temperatura ótima. Com exceção do íon Cu, todos os outros estimularam a atividade enzimática em relação ao controle, sobretudo na concentração de 5 mM. Nessa concentração, Na, Mg e Zn aumentaram em mais de 24% a atividade catalítica do extrato enzimático. O (-mercaptoetanol (inibidor de cisteína protease) não reduziu a atividade do extrato proteolítico. Poroutro lado, os inibidores HgCl2 (inibidor de serina proteases), EDTA (inibidor de metaloproteases) e PMSF (inibidor de serina proteases) inibiram entre 33-63% a atividade enzimática. As proteases foram fortemente afetadas pelos solventes hexano e tolueno (84-90%) e em menor extensão por 1-propanol, metanol e acetona (19-39%). Baseado nos resultados, conclui-se que o extrato enzimático possuiatividade ótima em pH 8,0 e temperatura de 40 ºC. A atividade proteolítica do extrato enzimático foi inibida na presença de Cu, (-mercaptoetanol, hexano e tolueno.


Palavras Chaves: Proteases, caracterização enzimática.

Data 02/07/2009



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OrientadorBolsista


1. Introdução



Programas visando selecionar novas fontes microbianas para a produção de enzimas estão crescendo no mundo todo (Stamford et al., 2001). O complexo nitrogenase presente nas bactérias genericamente conhecidas como rizóbio (gêneros Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium e...
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