Metodos para manipulação de proteina.

Métodos para manipulação de proteínas Cap 3 Lehninger pag.88

As proteínas podem ser separadas, purificadas, caracterizadas, quantificadas, seqüenciadas e até sintetizadas quimicamente.

A estrutura e função de muitas proteínas foram descobertas pela análise de proteínas isoladas

Objetivo: separar e determinar sua propriedade
• As células possuem milhares de diferentes espécies de proteínas. Como uma proteína pode ser purificada? ▫ Os métodos de purificação utilizam propriedades individuais de cada proteína:

 Tamanho
 Carga
 Propriedade de ligação (interações proteínaproteína ou proteína-ligando)

A fonte de proteína geralmente é o extrato bruto proveniente de células ou tecidos
• Devemos romper (lisar) as células ou tecidos para obter o extrato bruto:
▫ Tampão de lise: solução contendo reagentes para rompimento da membrana plasmática e liberação dos constituintes celulares
 Detergente, EDTA, EGTA, inibidores de proteases (Aprotinina,
Benzamidina, PMSF).

▫ Centrifugação diferencial freqüentemente é inicialmente utilizado para separação de componentes celulares
 Macromoléculas e componentes celulares possuem velocidades de sedimentação diferentes

FRACIONAMENTO próxima etapa para separação das proteínas (células)
1. DIÁLISE: utilização de uma membrana semipermeável para troca de sal e outras moléculas menores sem perda da proteína
(técnica baseada no tamanho das moléculas)

Membrana semipermeável Solução contendo proteínas com diferentes tamanhos ou sais

• Diálise
• Implicações práticas da osmose e difusão para a separação de moléculas 2. COLUNAS DE CROMATOGRAFIA: método mais eficiente de separação de proteínas (técnica baseada na diferença de cargas, tamanho e afinidade de ligação).
Composição:
• Coluna: tubo de plástico ou vidro
• Fase estacionária: material poroso sólido com determinada propriedade química
• Fase líquida: solução tamponada
• Amostra ou extrato protéico: colocada no