Mestrado

Protocolo Microdiluição
1º Diluição do extrato vegetal
- Pesar 0,25 mg do extrato e diluir em 10 ml de água destilada estéril.
2º Preparo do inóculo
- Inocular 3 a 4 colônias em tubos contendo 2 ml de solução salina.
- Turvar a 0,5 na escala de Mcfarland (1x108 UFC/ml).
3º Inocular 0,1 ml da suspensão (solução salina + inóculo) em tubos contendo 9,9 ml de caldo Mueller Hinton.
4º Colocar 200µl de caldo Mueller Hinton (MH) puro em cada poço da microplaca.
5º Diluir o extrato: 200µl no primeiro poço, seguindo uma diluição de 1:2, descartando os últimos 200 µl.
6º Inocular 10µl do caldo Mueller Hinton (microrganismo) em cada poço. Inocular controles positivo e negativo. Incubar em estufa a 37°c por 24 horas (atentar para a temperatura de determinados microrganismos).
7º Realizar a Concentração Bactericida Mínima (CBM).
- Inocular conteúdo de cada poço da microplaca em placas contendo ágar Mueller Hinton e incubar por 24 horas. A menor concentração onde não foi observado crescimento no ágar é considerada a CBM.

Materiais
Ágar MH (20 ml por placa)
Tubos com caldo MH (9,9 ml)
Tubos com solução salina (3 ml)
Ponteiras amarelas estéreis
Microplacas estéreis
Pipeta automática multicanal
Placa de Petri estéril

Esterilização placas
Placas sujas devem ser imersas em água sanitária por 24 h.
Lavar e por para secar.
Realizar fumigação: em uma placa de petri macerar 01 comprimido de permanganato de potássio, colocar as placas na estufa de fumigação abertas, após isso colocar o formol na placa com o permanganato (CUIDADO, POIS LIBERA GÁS TÓXICO). Deixar por 24 horas. Transferir as placas para câmara de UV e deixar por 24 horas. Guardas as placas em local apropriado.