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Materiais e Métodos

No experimento foram usados alguns reagentes para o preparo do lisado de levedura (tampão de lise): NaOH 0,2M, SDS 1% (p/v);
Tampão acetato de sódio 100mM pH 4,5;
Tampão citrato 200 mM pH 5,0;
Tampão citrato 200 mM pH 6,0;
Tampão fosfato 200 mM pH 7,0;
Tampão borato 200 mM pH 8,0;
Tampão borato 200 mM pH 9,0;
Tampão carbonato-bicarbonato 250 mM pH 11,0;
Os materiais utilizados foram: pipetadores, pipetas, ponteiras, suporte para tubos e tubos eppendorfs, utilizando-se de banho gelo e aparelhagem com banho a 37°C.
O experimento se dividiu em quatro etapas, a primeira delas foi feita no dia anterior e realizada pelo professor. Foi feita preparação da cultura de leveduras. Em um erlenmeyer de 200 mL, foram adicionadas 100 mL do meio YBD preparado anteriormente, havendo a inoculação com o auxílio de um palito, de uma colônia de Saccharomyces cerevisiae, sendo a mesma deixada à temperatura ambiente por 12h.
Após essa etapa, deu-se início a lise celular. 1 mL de cultura de leveduras foi colocado em tubos epperndorfs e as amostras foram centrifugadas a 13. 400 rpm por 10 min. O sobrenadante de todos os tubos foi retirado e recolocado em novos tubos. O pellet sofreu adição de 1.000 µL de tampão de lise e ressuspensas as células utilizando o vórtex. Foram utilizados 4 ciclos de congelamento com nitrogênio líquido para lisar as células. Sendo novamente centrifugado a 13.400 rpm por 10 mim, o sobrenadante foi guardado no gelo. Após isso, o mesmo ficou por 2 mim no congelador e 2 min em banho maria 37°C.
A terceira etapa do experimento consiste na diluição do lisado, que foi sempre mantido no gelo. 200 µL do lisado de levedura foram transferidos para um tubo de 2 mL e identificados como L10X. Após isso, foram adicionados 1,8 mL de solução de diluição (Tris HCL 10 mM, pH 7,0), e homogeneizado suavemente.
Para a quarta etapa, que consiste no ensaio de atividade enzimática, foram preparados em banho de gelo e para cada pH, um conjunto de tubos de acordo