Isolamento de protoplasto

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Universidade Federal do Espírito Santo Centro de Ciências Agrárias Programa de Pós-graduação em Produção Vegetal

ISOLAMENTO DE PROTOPLASTOS
Alunas: Anelise Marques
Angélica Nogueira Micheli Spadeto Alegre – ES 2012

INTRODUÇÃO
• A diferença fundamental entre células de plantas e a dos animais é que as células de plantas são totipotentes e podem se dividir e desenvolver em plantascompletas;
• Plantas apresentam também uma parede celular rígida constituída por: celulose, hemicelulose e pectina.

INTRODUÇÃO
• A parede celular -> é o maior impedimento na transferência direta de DNA para células individuais e na produção de híbridos somáticos pela fusão de células;
• Pode ser removida temporariamente de células de plantas sem perda significativa de viabilidade.

PROTOPLASTOS• É um estado transitório das células; • São células vegetais desprovidas de parede celular;

• Estado onde as células estão desprotegidas mediante processos mecânicos ou enzimáticos;
• Formam células individuais em cultura; • Sua totipotência permite a regeneração de plantas inteiras.

PROTOPLASTOS
• Vantagens sobre as células normais: • Fácil de introduzir materiais (ex: DNA);

•Fácil de estudar processos que ocorrem neles;
• Fácil de fundi-las com outras células.

PROTOPLASTOS
• Podem ser produzidos por dois procedimentos:
• Mecânico corte de tecidos de plantas;

• Enzimático  digestão da parede celular através de várias enzimas hidrolíticas.

PROTOPLASTOS
 Mecânico:
• Cortes numerosos são feitas através do tecido da planta; • Permite que alguns protoplastossejam liberados das células seccionadas; • Produção rápida de protoplastos em tecidos espessos como nos tubérculos de batata ou maçã, e produção baixa em feijoeiro.

PROTOPLASTOS
 Enzimático
• Protoplastos isolados por meio da digestão por enzimas extraídas de várias fontes (fungos e intestino de formigas): • Celulase; • Hemicelulase; • Pectinase;

• A digestão pela combinação destas trêsenzimas é geralmente conduzida em um pH de 5,5 – 5,8 por um período de 3-16h.
Não importa qual o procedimento utilizado, os protoplastos podem ser coletados e purificados por técnicas de centrifugação designadas para separar as células danificadas e quebradas de protoplastos intactos, partindo das suas diferentes densidades flutuantes.

PROTOPLASTOS
• Em 1892, já haviam sido obtidos osprimeiros protoplastos por meio de isolamento mecânico (KLERCKER, 1892);
• Em 1960, foram empregadas enzimas pectocelulolíticas para a obtenção de protoplastos, aumentando o rendimento do processo e abrindo perspectivas do uso deste sistema em pesquisas na biologia vegetal (COCKING, 1960);

• Em 1971, foram regeneradas as primeiras plantas a partir de protoplastos de Nicotiana tabacum (CARNEIRO etal., 1998).

IMPORTÂNCIA DOS PROTOPLASTOS
• Melhoramento de espécies de interesse agronômico para obtenção:

• Plantas transgênicas;
• Híbridos somáticos; • Mutantes ou variantes somaclonais;

• Para o estudo da expressão de genes isolados e sua regulação;

• 1ª - isolamento de protoplastos; • 2ª - fusão ; • 3ª - regeneração de plantas a partir dos tecidos selecionados, que serãoanalisados.

IMPORTÂNCIA DOS PROTOPLASTOS
 Parâmetros importantes para a obtenção de protoplastos viáveis:
• Espécie; • Estado fisiológico da planta;

• Tipo;
• Idade do explante; • Condições de isolamento dos protoplastos; • Utilizando uma mistura de enzimas pectocelulolíticas, protoplastos podem ser isolados a partir de qualquer tipo de tecido vegetal.

ETAPAS DE ISOLAMENTO DOS PROTOPLASTOSDesinfestação dos explantes Estado Fisiológico da planta

Fonte de explante

Testes de Viabilidade

Purificação dos Protoplastos

Degradação da parede celular

Cultura de Protoplastos

ETAPAS DE ISOLAMENTO DOS PROTOPLASTOS
 Fonte de Explante
• Mesófilo foliar, frutos, pecíolos, cotilédones, caules, grão de pólen, coleóptilos, pedicelos florais, calos e suspensões celulares...
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