Invertase

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Universidade Federal de São Paulo









Cinética Enzimática



Prof. Dr. Helotônio Carvalho
Profa. Dra. Karin Argenti Simon-Giavarotti











12 de Novembro de 2008
Objetivo

Este experimento teve o objetivo de estudar a influência da concentração de substrato na velocidade de uma reação enzimática e também de examinar as curvas obtidas, calculando parâmetroscinéticos, como Km e Vel máx e discutir os valores e importâncias dos mesmos.

Introdução

1. Enzimas

1.1 Características

As enzimas são caracterizadas por promoverem reações com alta eficácia, por necessitarem de brandas condições de reação, pela alta especificidade de substratos e produtos, pela sua capacidade de regulação e sua saturação pelo substrato.

1.2 Cinética enzimáticaA cinética enzimática estuda os mecanismos e a velocidade de reações químicas catalisadas pro enzimas. L Michaelis e M. Mentem descreveram um processo enzimático através do seguinte modelo simplificado:

[pic] (fórmula 1)
onde E é a enzima livre;
S é o substrato;
ES é o complexo enzima-substrato;
P é oproduto.
Esse modelo deu origem à equação de Michaelis Mentem:

[pic] (fórmula 2)
onde [S] é a concentração do substrato;
Vmáx é a velocidade máxima de reação;
Vo é a velocidade inicial de reação;
Km é a constante de Michaelis, que pode representar a afinidade da enzima pelo substrato.
Essa equaçãoexpressa a velocidade de uma reação catalisada enzimaticamente, permitindo a descrição do comportamento de diversas enzimas.
Nesse caso, o gráfico de Vo em função da concentração de substrato é uma curva hiperbólica. Dessa forma, o sistema tende a adquirir velocidade de reação máxima.

2. Invertase

A enzima invertase catalisa a hidrólise da sacarose, produzindo uma mistura equimolar deglicose e frutose (hexoses que constituem as principais fontes de energia para os seres vivos) que é denominada açúcar invertido.[1]
Figura 1: Hidrólise da sacarose catalisada pela invertase. Tanto a glicose quanto a frutose são açúcares redutores.



Materiais e métodos

Os materiais utilizados neste experimento foram:
- 13 tubos de ensaio grandes (180x20mm)
- 1 proveta de 25 mL;
- 1pisseta com água destilada;
- 1 estante para tubos;
- 2 cubetas para espectrofotômetro;
- 1 erlenmeyer com água destilada;
- 1 caixa com gelo contendo a enzima;
- 1 caneta para marcação de tubos;
- Fita crepe;
- Pipetas: de 2 e 5 mL;
- Micropipetas P200 e P 1000 e respectivas ponteiras;
- Banho fervente;
- Banho a 37°C;
- Tampão acetato 0,02M;
- Sacarose 1% (30mM) em tampão acetato.
-Solução Padrão Redutora 12mM (6.0 mM de glicose + 6.0 mM de frutose)
- Ácido 3,5 Dinitrosalicílico (DNS)
- Soluções de enzima invertase (8 ug/mL)

Parte A
Inicialmente foram adicionados a seis tubos de ensaio grandes volumes crescentes de solução padrão redutora, completando o volume em cada tubo para 2mL com a solução tampão. O reagente DNS foi acrescentado logo após o tampão, sendo 2,0mL em cadatubo. No tubo branco, não foi adicionada a solução padrão redutora. No tubo 1, foi adicionado 0,2 mL da mesma, no tubo 2, 0,4 mL, no 3, 0,6 mL, no 4, 0,8 mL e no 5, 1,0 mL, com o auxílio das micropipetas. Já o tampão, no tubo branco foram adicionados 2,0 mL, no tubo 1, 1,8 mL, no 2, 1,6 mL, no 3, 1,4 mL, no 4, 1,2 mL e no 5, 1,0 mL, também com o auxílio das micropipetas.
Após a adição do DNS, ostubos foram colocados em banhos-maria ferventes durante 10 minutos e em seguida esfriados em água corrente. Então foram adicionados 16 mL de água destilada em cada um dos tubos, com o auxílio da proveta. Os tubos foram então homogeneizados por inversão e as absorbâncias a 540nm contra o branco foram lidas e devidamente anotadas.


Parte B
Inicialmente, sete tubos de ensaio que estavam no...
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