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Detecção e quantificação da microcistina-LR em culturas e amostras ambientais por HPLC-DAD

I. Objectivos:
• Conhecer a técnica de HPLC acoplado com um detector de diodos (DAD);
• Conhecer as propriedades dos compostos a separar;
• Conhecer os efeitos toxicológicos da microcistina.

II. Introdução
A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma técnica de cromatografia em que a fase móvel utilizada é líquida. Esta fase móvel encontra-se sob pressão que passa com um determinado fluxo (mL/min) através de uma coluna que contem a nossa fase estacionária.
Existem vários tipos de cromatografia líquida que podem ser utilizadas no
HPLC: adsorção, partição, permuta iónica, exclusão molecular incluindo exclusão molecular e filtração em gel. Dentro da cromatografia de partição temos ainda a considerar o HPLC de fase normal e o HPLC de fase reversa que irá ser utilizado neste trabalho. Na cromatografia de fase reversa a fase estacionária não polar é uma fase ligada
(bonded) a uma matriz de partículas de sílica. Um exemplo é as colunas C18 em que na matriz de suporte está ligado uma cadeia com 18 átomos de carbono. A fase móvel a ser utilizada neste tipo de coluna é uma mistura de solventes mais polares. Nestas condições, os compostos polares perferem permanecer na fase móvel, sendo eluídos antes dos menos polares que têm maior afinidade para com a fase estacionária.
A eluição da coluna pode ser feita com um só solvente, o processo de eluição isocrático, ou com vários solventes, o processo de eluição gradiente. Para se conseguir um processo de eluição gradiente recorre-se à programação do software do HPLC.
A percentagem de cada um dos solventes é escolhida segundo a sua afinidade com as moléculas a separar, isto é, quanto maior a “força” de um solvente mais este tem capacidade de eluir a nossa molécula resultando um tempo de retenção pequeno.

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