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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA – CLAE (HPLC)

ELAINE LOPES
JULHO/2012

INTRODUÇÃO A CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
CROMATOGRAFIA

Vem do grego “CHROMA”, que significa “COR”

Vem do grego “GRAPHE”, que significa “ESCREVER”

Métodos cromatográficos, de uma forma geral, permitem a separação, quantificação e identificação de espécies químicas, ENTRETANTO a Cromatografia Líquida é umatécnica de separação de grande resolução, mas não identifica com precisão o composto.

INTRODUÇÃO A CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

 

Entre as vantagens desta técnica  Diversidade de suas aplicações;
Desvantagens  custo dos equipamentos, tempo para formação de um técnico ; Uma expressão usada é que “os tempos de retenção são característicos, porém não são exclusivos”. Emprega-se outras técnicas espectrometria de massas, espectrometria de infravermelho ou ressonância magnética;



INTRODUÇÃO A CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Princípio da Técnica


Separação  pela distribuição destes componentes em duas fases que se

encontram em contato;


Durante a passagem da fase móvel pela estacionária, os componentes da

mistura são seletivamente retido pela
fase estacionária;


Aretenção seletiva pode operar por mecanismos entrópicos e entálpicos.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Tipos
 

Cromatografia Líquida Clássica  colunas de vidro; Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ou High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC)  auxílio de uma bomba de alta pressão;

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Classificação pelos mecanismos de separação



Adsorção-CromatografiaLíquido-sólido  Competição pelos sítios ativos da fase estacionária; Partição-Cromatografia líquido-líquido  Baseada nas diferenças de solubilidade dos componentes; Troca iônica  Diferentes tendências dos componentes iônicos da amostra a permutar com os íons da fase estacionária;







Exclusão  Os componentes são separados conforme o tamanho efetivo das
moléculas.

CROMATOGRAFIALÍQUIDA
Definições


Cromatografia em Fase Normal
 Fase Móvel  APOLAR  Fase Estacionária  POLAR  Exemplo  uso de sílica gel com hexano ou diclorometano.

Fase Móvel

Fase Estacionária



Cromatografia em Fase Reversa
 Fase Móvel  POLAR  Fase Estacionária  APOLAR  Exemplo: uso de sílica gel modificada (C18) com metanol/água.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Definições


Tempode Retenção de “A” (Tra)  Amostra introduzida no sistema até o ponto máximo do

pico da amostra.


Tra = tr-to

Fator de Capacidade (K’) de “A”  Velocidade com que um dado composto migra ao longo da coluna. K’a = Tra-to



Tempo morto(to)  Amostra não retida na coluna; Tempo de retenção da fase móvel.



Resolução  Medida quantitativa da separação de dois picos consecutivos.OBS: Quando R = 1,5  separação é completa; Quando R = 1,0  os picos estão somente 90% resolvidos.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Definições

Figura: Resolução entre dois picos.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
Definições
 Eficiência da coluna  Número de pratos teóricos (N);  Quanto maior o valor de N  MAIOR a eficiência da coluna;

 Exemplos de Eficiências de Colunas:

CROMATOGRAFIA LÍQUIDAAplicabilidade Alimentos Cosméticos Fármacos

HPLC
Polímeros
Corantes Aminoácidos, etc.

SISTEMA CROMATOGRÁFICO
Esquema Básico do Aparelho


O sistema cromatográfico é composto de:
 Reservatório e sistema de Bombeamento da Fase Móvel (Solvente ou Solventes)  Sistema de Introdução da Amostra  Sistema Analítico (Coluna Cromatográfica – Fase Estacionária)  Sistema de Detecção Sistema de Registro e Tratamento dos Dados

SISTEMA CROMATOGRÁFICO
Bombas cromatográficas – Aspectos Importantes
  

Pressão máxima de operação, fluxo, reprodutibilidade e constância do fluxo;
Todo solvente deve ser filtrado e desgaseificado; Deve apresentar resistência a líquidos corrosivos, a facilidade de troca de fase

móvel e a limpeza do sistema;


É importante o estudo do...
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