HIBRIDIZA O

HIBRIDIZAÇÃO
1. Sondas de DNA e hibridização com DNA ou RNA
Uma sonda de DNA é um DNA fita simples, de tamanho pequeno (em geral ente 50 e 300 bases), que está marcado com uma substância radiativa ou conjugado a um produto qualquer que permita sua visualização numa etapa final do ensaio de hibridização. Assim, o objetivo de uma sonda é encontrar (hibridizar com) um trecho de um DNA para o qual ela seja pelo menos parcialmente complementar, e permitir a posterior localização de sua presença num ensaio qualquer: num Southern blot (como uma banda), num dot assay (como um ponto), num ELISA (como substrato colorido), etc.
1.1. Preparação de sondas de DNA
As sondas de DNA vão servir, em geral, para vários tipos de testes de hibridização. Estes testes têm, em comum, o objetivo de identificar visualmente uma sequencia de ácido nucleico (em geral DNA, mas também em alguns casos RNA). As sondas de DNA podem ser feitas como fitas duplas ou fitas simples, mas para funcionarem nos ensaios de hibridização, elas devem ser desnaturadas, numa primeira etapa, se forem feitas como fitas duplas.
As sondas convencionais são feitas de DNA clonado num plasmídeo. A partir deste plasmídeo é possível produzir fitas simples de DNA copiadas do trecho clonado, como primeiro passo para a produção de sondas fitas simples. Pode-se também amplificar o DNA clonado por PCR (empregando primers que hibridizam com as regiões flanqueadores do inserto no plasmídeo). Estas duas formas básicas de iniciar a produção de sondas fita simples ou fita dupla estão mostradas na figura 1 abaixo: Um pedaço de DNA fita dupla (em segmento de um gene, uma região com repetições, uma região telomérica, etc.) pode ser clonado num plasmídeo e a partir desta construção pode-se produzir uma fita simples (por extensão de um primer, à esquerda, como na parte A da figura 1) ou por PCR, à direita. Pode-se, neste processo, incorporar, por exemplo, um precursor radioativo de uma das bases nitrogenadas, e a fita simples ou dupla