Fungos filamentosos

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  • Publicado : 13 de setembro de 2011
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Procedimentos para identificação de fungos filamentosos:
A identificação de fungos filamentosos objetiva a observação da morfologia da colônia e aspectos microscópicos. A análise da colônia consiste em observar a cor, textura, superfície, pigmento difusível no meio de cultura, entre outros, e pode ser feita no tubo de ensaio contendo a cultura primária do fungo.Porém, o mais adequado é a análisea partir da “colônia gigante’, ou seja, uma cultura feita no ponto central de uma camada de ágar distribuído em placa de Petri. A velocidade de crescimento é indispensável para identificação do fungo.O diagnóstico de espécie de fungos filamentosos é um procedimento absolutamente artesanal.O critério de identificação dos fungos filamentosos é basicamente morfológico sendo que as chaves deidentificação são compostas por elementos caracterizados a partir da análise micromorfológica do micélio reprodutivo destes agentes.Mesmo em países desenvolvidos,poucos gêneros de fungos são hoje diagnosticados por métodos moleculares,sendo que a maioria dos centros médicos utiliza esta ferramenta exclusivamente em projetos de pesquisa.
A observação das estruturas microscópicas(hifa hialina ou demácia,septada ou cenocítica, forma, disposição e formação dos esporos) são suficientes, em geral, para a identificação de fungos filamentosos. A morfologia microscópica é melhor visualizada com a técnica de microcultivo que preserva a disposição original dos esporos sobre as hifas e mantém íntegras certas estruturas formadoras de esporos. Para a identifiação adequada Coloca-se sobre uma lâminaesterilizada, contida em uma placa de Petri estéril, um cubo de ágar: ASD ou ágar batata. A lâmina deve estar sobre um suporte, que pode ser formado por outra lâmina, ou um pequeno bastão de vidro recurvado, ou ainda, dois palitos de fósforo.
Semear o fungo, a partir de repique recente, nos 4 lados do cubo de ágar. Recobrir com uma lamínula esterilizada. Fazer uma câmara úmida, adicionando 1 a 2 ml deágua destilada estéril no fundo da placa ou embeber um pequeno chumaço de algodão estéril, para evitar a dessecação do meio de cultura, durante o crescimento do fungo. Tampar a placa e deixar à temperatura ambiente por 7 a 10 dias, até que se observe desenvolvimento de hifas com ou sem pigmentação.
Após esse período, inativar a esporulação, adicionando 1 ml de formol ao algodão e vedando a placacom fita adesiva durante 24h-48h. O vapor de formaol, além de inativar o fungo, irá auxiliar na fixação das estruturas microscópicas. Retirar a lamínula com auxílio de uma pinça, cuidadosamente, uma vez que nela deverão estar aderidas as hifas e esporos do fungo. Pingar uma gota de corante azul de lactofenol-algodão (“Cotton Blue”) e montar sobre uma lâmina. Desprezar o cubo de ágar e, em seulugar, pingar outra gota de corante azul e recobrir com lamínula, para visualizar esporos e hifas também aderidos à lâmina. Observar em microscópio ótico com objetiva de 40 X, o tipo e cor da hifa, forma disposição e formação de esporos.
Ex: Isolamento e identificação de fungos filamentosos a partir de “Cannabis Sativa l.”
2.1- Amostragem
Utilizou-se amostras de Cannabis sativa L. de Campinas(IML), as quais permitam visualizar macroscopicamente a presença de fungos.
2.2 – Meio de cultura
Âgar Saboraud Dextrose (ASD) *
Este meio foi preparado segundo as instruções do fabricante e autoclavado a
121°C por 15 minutos. O meio será armazenado em balão de 100 ml sendo fundido no momento do uso.
Para estudos das colônias fúngicas, volume de 20 mL do meio foram vertidos em placasde Petri (15 x 100mm). Para manutenção dos fungos, volumes de 5 mL foram distribuídos em tubos de ensaio (10 x 145 mm), esterilizados e solidificados em posição inclinada.
2.3 – Extração dos fungos
Cinco gramas da amostra foram colocada em um graal de porcelana e diluída em 50ml de água destilada. Em seguida, a solução foi filtrada com gaze em funil de vidro,para um tubo de ensaio com...
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