Fisiologia Vegetal

Relatório Prática 2 – Reação de Hill

Objetivos: Isolar cloroplastos íntegros de folhas de espinafre e verificar a transferência de elétrons durante o processo fotossintético.

Materiais:

Erlenmeyer 250 ml
Vidro de relógio médio
Tampão Tris-sacarose (0,3 M de sacarose, 0,2 M Tris- HCl, 5mM MgSO4, pH 7,5), 100 ml
Gaze
Papel alumínio
Papel celofane (azul, vermelho e verde)
Pipeta plástica
Tubo falcon 50 ml (2x)
Centrífuga
Liquidificador
Espectrofotômetro
Cubeta
Gelo picado
Lâmpadas e adaptadores para tomada
Folhas de espinafre
DCIP

Procedimentos: Etapa 1: Extração da clorofila

1 - Pesar 40g de folhas de espinafre fresco (sem as nervuras centrais)
2 - Colocar as folhas no liquidificador junto a 100 mL do tampão
3 - Bater por aproximadamente 10s
4 - Filtrar a mistura com a gaze e depositá-la em um erlenmeyer coberto por papel alumínio
5 - Dividir o homogenato filtrado em 2 tubos de 50mL (Tubos Falcon)
6 - Centrifugar por 5 min a 1000 x g a 4ºC
7 - Retirar o material da centrífuga e descartar o sobrenadante (tomar cuidado para não ressuspender o pellet)
8- Ressuspender o pellet com 15 mL de tampão Tri-sacarose gelado com a pipeta de plástico
9- Guardar a suspensão de cloroplastos no gelo protegidos de luz.

Etapa 2: Medição do nível de absorbância da clorofila de acordo com diferentes luzes.

1 - Envolver os tubos de ensaios com os materiais fornecidos ( papel alumínio e papel celofane)
2 - Adicionar a suspensão de cloroplasto no tubo 1 (escuro), anotar o tempo, misturar, passar a amostra para a cubeta e ler sua absorbância imediatamente. Após 10 min no escuro, ler novamente a sua absorbância. Anotar os resultados.
3 - Adicionar a suspensão de cloroplasto no tubo 2, anotar o tempo, misturar, passar a amostra para a cubeta e ler sua absorbância imediatamente. Deixar a amostra por 10 min próximo a luz e após o tempo, ler novamente sua absorbância. Anotar os resultados.
4- Repetir o passo 3 para os demais tubos.