Extração de dna

Extração de DNA
Materiais:
Abelhas; Laminas de bisturi; Placas de Petri; Bastões de vidro; Luvas; Ependorfs; estantes para ependorfs; micropipetas; Vortex; Micro centrifuga; Banho maria.
Soluções:
Tris-HCL 10mM, pH 7,5;Tampão de Extração;Proteinase K (5mg/mL), conservada em frezer;NaCl 5M;Etanol P.A. (absoluto);Etanol 70%TE (Tampão de Eluição).Obs. Todas as soluções já se encontravam preparadas.
Procedimentos:
Nesta prática foi utilizada uma técnica para amostras com pequena quantidade de DNA. Foram coletadas três amostras de fragmentos (Melípona sp) de tórax, asas e tarso.
1.) Separou-se 10 a 50mg de uma abelha (Melípona sp)o tórax, a asa e tarso;
2.) Macerou-se as amostras individualmente em placas de Petri;
3.) Transferiu-se o macerado (amostras) para tubos de ependorf de 1,5mL;
4.) Microcetrifugou-se as amostras para concentrar-las no fundo dos ependorfs;
5.) Lavou-se as amostras em solução Tris-HCl 10mM em pH 7,5 por 5 min;
6.) Microcetrifugou-se por 10s, removeu-se o sobrenadante;
7.) Adicionou-se 300μL de Tampão de Extração, colocando-se em seguida 10μL de Proteinase K (de acordo com o tecido utilizado);
8.) Misturou-se bem, (microcentrifugar,vortexar) e colocou-se em banho maria por 2 a 3h, agitou-se ocasionalmente por inversão a cada 20min., ate dissolver o tecido;* Esta etapa pode permanecer over night a 37ºC.** Os procedimentos dos itens 9 a 19 só foram realizados na aula do dia seguinte.
9.) Retirou-se do BM, vortexou-se e centrifugou-se rapidamente (13.000 rpm por 5min a 20ºC);
10.) adicionou-se 100μL de NaCl 5M; vortexou-se por 10min;
11.) Centrifugou-se (13.000 rpm por 10min a 20ºC);
12.) Coletou-se o sobrenadante para outro tubo ependorf;
13.) Adicionou-se 1 mL de álcool P.A. gelado;* **Agitou-se e observou-se a formação de uma nuvem (filamentos) de DNA.**** Esta etapa pode permanecer over night a -20ºC.
14.) Centrifugou-se (13.000 rpm por 10min a 4ºC), e desprezar o sobrenadante, conservando-se o pellet formado;
15.)