Extra O Com Kit

UNICRUZ - LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS

PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO
Código:
POP: 0003

EXTRAÇÃO DE DNA POR PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS (com kit)

Pag. 1
R.T.

Data da elaboração
Agosto 2014
Data da aprovação
Data da 1ª revisão
Agosto 2014

Princípio do teste: Ao utilizar a solução de lise celular teremos o rompimento das membranas celulares das células sanguíneas, seguido do acréscimo de tampão de lise nuclear que proporcionará a lise da membrana do núcleo onde se encontra o DNA. A solução de precipitação de proteínas permite a sedimentação das partícula existentes do DNA a ser extraído. Após a etapa de desproteinização o isopropanol e álcool 70% auxiliam na etapa final de concentração da molécula do DNA, lavando-a e concentrando-a. A solução reidratante permite a total hidratação o DNA deixando-o pronto para análise.
Aplicação clínica: A extração de DNA por método de biologia molecular garante a detecção precoce de doenças causadas por vírus de DNA, bem como permite diversas análises envolvendo resolução de crimes, paternidade, entre outros.
Amostra: Sangue total.
Equipamentos: Banho maria, microcentrífuga, vórtex.
Procedimento:
Pipetar 300 µl de sangue total em ependorff de 0,5mL.
Adicionar 900 µl de solução de lise celular.
Aguardar aproximadamente 10 minutos.
Homogeneizar por inversão.
Centrifugar a 13.400rpm durante 1 minuto.
*Equilibrar a microcentrífuga.
Descartar o sobrenadante com pipeta.
Adicionar 300 µl de tampão de lise nuclear.
Homogeneizar por inversão.
Adicionar 100 µl de solução de precipitação de proteínas.
Agitar no vórtex durante 20 segundos.
Entrifugar a 13.400rpm durante 3 minutos.
Separar o sobrenadante após a centrifugação para um novo ependorff de 0,5mL
Adicionar 500 µl de isopropanol (gelado).
Ressuspender com a ponteira.
Centrifugar a 13.400rpm durante 2 minutos.
Inverter o tubo e descartar sobrenadante.
Adicionar 300 µl de álcool 70% (gelado).
Ressuspender com a ponteira.
Centrifugar a 13.400rpm durante 2 minutos.