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Arquitectura e Dinâmica Celulares

Protocolo Experimental – Viabilidade celular/Fluorescência

Reagentes a utilizar:
* Solução de diacetato de fluoresceína (DAF)[1] (0,1% p/v, em acetona).* Solução de iodeto de propídeo (IP) [2].

Células em estudo:
* Células neuronais.

Objectivos:
* Identificar a partir da utilização da técnica de fluorescência utilizando flurofóros,nomeadamente, IP e DAF, quais as células neuronais viáveis e quais as não viáveis.

Procedimento experimental:
1. Preparar num Erlenmeyer uma suspensão de células neuronais;
2. Retirar 2 ml doErlenmeyer uma porção da suspensão celular, para um tubo eppendorf, utilizando uma micropipeta.
3. Adicionar 20 µl neste mesmo a solução de DAF.
4. Seguidamente introduzir 2 µl, no mesmo tubo, asolução de IP.
5. Incubar o eppendorf durante cerca de 15 minutos, à temperatura ambiente.
6. Retirar uma pequena porção, de cerca de 160 µl da suspensão previamente preparada para uma lâmina de vidro.
7.Posteriormente, cobrir cuidadosamente com uma lamela e observar num microscópio de fluorescência, com os filtros adequados aos fluoróforos utilizados.
8. Identificar as células neuronais viáveis enão viáveis a partir da coloração que estas apresentem.

Considerações em relação aos reagentes:
Tratam-se de flurofóros, sendo utilizados para demonstrar a fluorescência diferencial do citoplasma ede organelos, em diferentes condições.
[1] – Especialmente utilizada para estudos de viabilidade celular. A membrana celular é permeável à entrada livre deste fluorofóro, devido à acção das esterasessobre este, resultando fluoresceína. Assim, as células viáveis deverão emitir fluorescência amarelo-esverdeada, quando submetidas à radiação do espectro luminoso com 400 nm de comprimento de onda,como resultado da acumulação de fluoresceína.
[2] – O iodeto de propídeo entra nas células cuja membrana celular tenha perdido integridade e ligando-se ao DNA desta. Surge com coloração vermelha...
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