Enzimologia

CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE QUÍMICA
UNIDADE RIO DE JANEIRO
COORDENAÇÃO DE BIOTECNOLOGIA
BIOQUÍMICA (Laboratório 318)

CINÉTICA ENZIMÁTICA: a. CURVA PADRÃO DE PNP b. CURSO TEMPORAL c. INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA d. INFLUÊNCIA DO pH
e. CURVA DE SUBSTRATO f. INFLUÊNCIA DO INIBIDOR

Material:

Solução padrão de p-nitrofenol (PNP) 0,1 mM em tampão Tris-HCl pH 9,5
Solução de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 1 mM tampão Tris-HCl pH 9,5
Solução tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 7,5, 8,5 e 9,5
Solução de Na2HPO4 0,4 mM em tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 9,5 (sol. tampão Tris-Pi-HCl)
Soluções tampão borato-NaOH 0,3 M, pH 9,5, 10,5 e 11,5
Soluções tampão citrato HCl 0,2 M, pH 5,5, 6,5 e 7,5
Solução de NaOH 2 M
Solução de enzima: fosfatase alcalina 2 g/mL (Sigma Fine Chemicals - EC 3.1.3.1)
Pipetador automático 20 - 200 L
Pipetas de 1, 2 e 5 mL
Pró-pipetes
Tubos de ensaio
Vortex
Banho de gelo (0 oC)
Banho-maria (25 oC)
Banho-maria (37 oC)
Banho-maria (68 oC)
Cubetas
Espectrofotômetro obs.:Tris = [tris(hidroximetil)aminometano] ou 2-amino-2(hidroximetil)- 1,3 propanodiol

Avaliação cinética da reação:

Método:

a. Construção de uma curva padrão de PNP

1. Transfira, com auxílio de pipeta e pró-pipete, alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo:
2. Homogeneize os tubos manualmente, se preferir use o vortex.
3. Proceda a leitura espectrofotométrica da absorbância, a 405 nm, de cada um dos tubos, utilizando o tubo “branco” como referência de calibração para o aparelho.

Tubo no
Solução padrão de PNP (mL)
Tampão Tris-HCl, pH 9,5 (mL)
Solução de NaOH 2M (mL)
ABS.
405 nm nmoles de PNP
B
-
3,2
1,0

1
0,3
2,9
1,0

2
0,6
2,6
1,0

3
0,9
2,3
1,0

4
1,2
2,0
1,0

5
1,5
1,7
1,0

6
1,8
1,4
1,0

Obs.: Note que o volume final dos tubos é rigorosamente o mesmo em todas as práticas!

b. Curso