eletroforese

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ELETROFORESE

DEFINIÇÃO
• É uma técnica laboratorial de separação de
frações de proteínas, enzimas, DNA e RNA,
baseada na migração das moléculas carregadas,
numa solução, em função de aplicação de um
campo elétrico.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS
• Introduzida por Arne Tiselius em
1937, foi inicialmente realizada em
meio líquido, sendo posteriormente
aperfeiçoada com emprego de ummeio-suporte.
• É uma técnica versátil, relativamente
simples, rápida e de grande poder
informativo, tornando-se indispensável
nas mais diversas áreas da biologia
molecular.

POTENCIAL DE USO
1. Estudo clínico do plasma e líquido de mamíferos;
2. Resolução de misturas complexas de:
•. proteínas;
•. ácidos nucléicos;
•. aminoácidos;

POTENCIAL DE USO
3. Identificação de componentes;
4.Determinação da pureza:
• pureza e homogeneidade molecular;
• genética molecular;

PRINCÍPIOS DA TÉCNICA DE
ELETROFORESE
• A eletroforese consiste na migração de moléculas
ionizadas, de acordo com as suas cargas elétricas e pesos
moleculares em campo elétrico.
• Moléculas com cargas negativas migram para o polo
positivo (ânodo) e moléculas com cargas positivas migram
para o polo negativo(cátodo).
• Em razão das proteínas serem substâncias anfóteras, é
indispensável manter constante o pH do meio durante a
eletroforese, através do uso de soluções-tampão para não
gerar cargas, as quais podem interferir na corrida.

CONDUÇÃO DA
ELETROFORESE
• Gradiente de densidade
• Meios de suporte:
-

Papel filtro;
Sílica gel;
Membrana de acetato de celulose;
Amido;
Gel deagarose;
Poliacrilamida

Fatores que influenciam na
condução Eletroforética
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

pH do meio
pI (ponto isoelétrico) ou pK das substâncias
Eletrólitos usados
Interações com a fase fixa
Temperatura
Evaporação
Movimentos hídricos no suporte

Pela simples variação do pH, é
possível :
• Separar uma proteína de várias outras
• Separar um grupo de proteínas associadasem
seus componentes
• Determinar o ponto isoelétrico de proteínas
• Estudar a associação antígeno-anticorpo

TEMPERATURA
Quanto mais elevada a voltagem ou a intensidade
da corrente, maior será o aumento da temperatura.
No caso de eletroforese de isoenzimas e de
proteínas, as temperaturas elevadas podem
degradar as enzimas e proteínas, o que, pode
resultar na perda de atividadeenzimática e
protéica.

VISUALIZAÇÃO DAS BANDAS
• PROTEÍNAS: corante " coomasie blue"
• ENZIMAS: solução específica (substrato,
coenzimas, solução-tampão e sais)
• DNA e RNA: vários sistemas de revelação,
como:
- Fluorescência( Brometo de
Etídeo);
- Radioatividade;
- Nitrato de prata;

SISTEMAS DE RESOLUÇÃO

Agarose
Brometo de Etídeo
U.V.

Poliacrilamida
Nitrato de prata SISTEMAS DE
ELETROFORESE
• POSIÇÃO DO GEL: vertical ou horizontal;
• POROSIDADE: contínuo ou descontínuo;
• PASSAGEM DA CORRENTE: unidirecional ou bidirecional

TIPOS DE ELETROFORESE
• Eletroforese livre
• É método em desuso devido a perturbações ( ondas
mecânicas, e movimentos de convecção de líquido).

• Eletroforese em suporte
• As substâncias são separadas em meios sólidos ou semisólido.Não há perturbações.

ELETROFORESE EM GEL
• Eletroforese em gel é eficiente em promover a
separação de partículas de acordo com o seu
tamanho.

GEL DE AGAROSE
• Utilizada para separação de partículas
relativamente pequenas e partículas grandes;
• Mais utilizado para separação de fragmentos
longos de DNA;
• Gel gelitificado de agarose;
• Corrente elétrica sobre gel;
• Partículasmenores tem maior velocidade para
chegar ao polo positivo.

ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

• É utilizado em uma cuba horizontal ligada a uma
fonte de energia. Uma solução tampão é
adicionada à cuba, onde irá manter estáveis as
condições de pH no meio.

ELETROFORESE EM GEL DE
POLIACRILAMIDA
• A poliacrilamida também pode ser utilizada como
gel para a eletroforese.
• É uma mistura...
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