Eletroforese

Eletroforese

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Nome: Amanda Corrente Martins Matricula: B421662
Larissa Rezende Matricula: B240JF-5
Fernanda Dutra Matricula: B248DI-7
Matéria: Biofísica Profª LeilaRibeiro


Eletroforese

A eletroforese é uma técnica analítica utilizada na análise de macromoléculas como proteínas e ácidos nucléicos. Essa técnica foi descoberta e empregada pela primeira vez em 1937 por Arne Tisélius um bioquímico russo. O efeito eletroforético tem como base a teoria de Debye-Hückel-Onsager, onde esta teoria de dissociação eletrolítica aceita o fato de as partículas carregadasmoverem-se sob a influência de forças eletrostáticas para um eletrodo de carga oposta quando é aplicada uma diferença de potencial  em uma solução contendo eletrólitos.
A eletroforese é a migração de uma molécula carregada sob a influência de um campo elétrico. A mobilidade eletroforética é dada por:
μ= v/E = Z/f
Onde:
A mobilidade eletroforética (μ) é a razão entre a velocidade (v) damacromolécula e o potencial elétrico (E) que move a macromolécula ou a razão entre a carga líquida (Z) e o coeficiente de atrito(f).

Suportes para eletroforese

Os suportes para eletroforese comumente empregados são os géis de poliacrilamida para proteínas e agarose para os ácidos nucléicos, em virtude de estes polímeros funcionarem como uma peneira molecular, ou seja, separar as espécies em funçãode sua massa e tamanho molecular, respectivamente, inibe a propagação do calor em virtude do atrito causado pela migração e pela aplicação do campo elétrico.
Os géis de poliacrilamida são comumente utilizados na separação de proteínas em virtude de ser quimicamente inertes, facilidade de coloração com nitrato de prata e corante azul de Coomassie (corantes como esses coram totalmente a agaroseimpossibilitando a identificação das espécies no eletroforetograma), os poros são facilmente ajustáveis através do controle de acrilamida e bis-acrilamida que são os polímeros que formam o gel.
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Os géis de agarose são utilizados para mac moléculas com massa molecular a superior a 200 kD visto que os ácidos nucléicos apresentam massas moleculares extremamente grande. A coloração doeletroforetograma de ácidos nucléicos é realizada como brometo de etidio, em função dos outros corantes provocarem a coração total do gel de agrose impossibilitando a identificação dos ácidos nucléicos.
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Estrutura Química da agarose
















Eletroforese de macromoléculas em Gel de SDS

A amostra de interesse deve ser preparada com o rompimento da matriz em que se encontra ocomposto de interesse, nesse caso é uma célula que é rompida por métodos, físicos ou químicos onde os métodos físicos incluem destruição mecânica ou maceração e métodos químicos funcionam através do rompimento por meio da adição de compostos químicos que não afetem as características físico-químicas, do composto de interesse.
Após a essa preparação a amostra é colocada em uma solução chamada detampão de amostra que contém em sua composição agentes químicos redutores, desnaturantes e tamponantes. Em seguida essa solução é aquecida a 90ºC por um período de 5 a 10 minutos para desnaturação da macromolécula. Uns exemplos desses agentes são:
SDS ou dodecilsulfato de sódio: é uma molécula anfifílica usada como desnaturante, ou seja, é um detergente que é adicionado a solução com o objetivode proporcionar uma carga liquida negativa para a biomolécula de interesse, de modo que ele agrega-se ao redor desta.
Agentes redutores: os agentes redutores comumente utilizados são β-mercaptoetanol  o DTT (ditiotreitol), que agem causando a redução das pontes dissulfeto que são responsáveis pela estrutura nativa da proteína.
Resumidamente o procedimento para eletroforese de macromoléculas é o...
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