Eletroforese

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Universidade Federal de Pernambuco
Curso de Engenharia Biomédica

ELETROFORESE

Gabriela Nery França
Maria Eduarda Malta

Cidade Universitária
2011

Introdução

A eletroforese foi introduzida cientificamente em 1939 por A.Tiselius e A.E. Kabat com o objetivo de separar partículas orgânicas. A técnica é fundamentada na separação de material orgânico (proteínas, enzimas, DNA, RNA),inicialmente realizada em meio líquido, sendo posteriormente aperfeiçoada com o emprego de um
meio-suporte (Acquaad, 1992). Na década de 1950, a técnica recebeu impulso e aperfeiçoamento, a partir dos experimentos de Smithies (1955) e de Hunter & Market
(1957), havendo forte aceitação nas décadas posteriores.
Consiste na migração de moléculas ionizadas de acordo com suas cargas elétricas epesos moleculares em campo elétrico. Moléculas com carga negativa migram para o pólo positivo (anodo) e moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo (cátodo). Em análises de proteínas é necessária a utilização de uma solução tampão visando manter o pH da solução constante, tendo em vista que dependendo do pH a carga das proteínas pode ser modificada.
O sistema-tampão usado consiste emduas partes: o tampão do gel usado na
preparação do gel e o tampão do tanque, ou cuba eletrolítica, na qual se encontram os
eletrodos (ânodo e cátodo). Para que a técnica funcione, deve ser desenvolvida sob voltagem(V), corrente (I), e potência (W) constantes, fornecidas por uma fonte apropriada de energia que tem por principio converter a corrente alternada em corrente continua.
Utiliza-se umacuba com dois compartimentos separados por 5 a 10cm. Num compartimento o eletrodo com fio preto determina o pólo negativo, e no outro compartimento o eletrodo com fio vermelho é o pólo positivo. Nos dois compartimentos colocam-se a solução tampão com pH definido, e entre os compartimentos ajusta-se o suporte da eletroforese (agarose, acetato de celulose, gel de amido, gel de poliacrilamida). Osuporte utilizado deve estar em contato com a solução tampão dos dois compartimentos. As amostras a serem analisadas são aplicadas no suporte escolhido (gel de agarose, acetato de celulose, etc.). Para que proteínas, enzimas, DNA ou RNA se fracionem é necessário passar no suporte uma corrente elétrica cuja voltagem e miliamperagem variam conforme os tipos de solução tampão, suporte e amostra a serfracionada. Após a “corrida” eletroforética, o suporte é retirado da cuba e corado com corantes específicos por tempos variáveis, e descorados a seguir. As análises podem ser qualitativas ou quantitativas – estas últimas por densitometria ou eluição.

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Eletroforese de Agarose

A técnica de separação dos fragmentos de DNA mais utilizada é aeletroforese através de géis de agarose. Este é o método padrão usado para separar, identificar, analisar, caracterizar e purificar fragmentos de DNA. A técnica é simples, rápida e capaz de separar misturas de fragmentos de DNA que não podem ser separados por outros métodos. A agarose é um polissacarídeo que dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria como a gelatina (Figura 1). Pararealizar uma eletroforese, um gel de agarose é preparado, o DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma corrente elétrica é aplicada através do gel. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o material deve migrar através do gel de agarose. (Figura 2)
Os fragmentos menores podem migrar através de um gel de agarose mais rapidamente que os fragmentos maiores. Após a eletroforese em gel,os fragmentos são corados com alguma substância possui afinidade tornando-a visível, as bandas no gel são coloridas principalmente por Brometo de Etídeo em baixa concentração, que colore por intercalar-se na dupla fita de DNA, em contato com a luz ultravioleta. Dessa forma pode-se localizar as bandas que correspondem ao material. .
Cadeias de DNA e RNA são chamados de poli-ânions e migram para...
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