Dna recombinante

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Alexandra A. C. Nascimento Enilza Maria Espreafico Maria Luisa Paçó Larson Nádia Monesi Nilce Maria Martinez Rossi Vanderlei Rodrigues

Revisão 1: Eliana Valéria Patussi Márcia A. S. Graminha Revisão 2: Fábio Márcio Squina Josane de Freitas Sousa Roberto Ruller Valeria Valente

2003

I.CONCEITOS BÁSICOS 1. INTRODUÇÃO Até a década de 70, o DNA era o componente celular mais difícil de ser analisado. Sua sequência de nucleotídeos de enorme tamanho e monotonia química era geralmente analisada através de meios indiretos como a sequência de proteínas e análise genética. A partir da década de 70 novas tecnologias foram desenvolvidas permitindo o isolamento e a purificação de genesespecíficos num processo chamado de clonagem gênica. Na verdade, muitas destas técnicas são provenientes da Microbiologia, Bioquímica, Imunologia e Genética Microbiana e permitiram que a análise do DNA ganhasse um novo enfoque. O DNA tornou-se então, a molécula mais fácil de ser analisada, sendo possível isolar regiões específicas, obtê-las em grande quantidade e determinar a sua seqüência numavelocidade de milhares de nucleotídeos por dia. A Tecnologia do DNA recombinante, como se convencionou denominar este conjunto de técnicas, tem uma ampla aplicação. Ela pode ser usada para estudar mecanismos de replicação e expressão gênica, na determinação da seqüência de um gene e conseqüentemente da proteína que ele codifica, ou no desenvolvimento de culturas microbianas capazes de produzir substânciasúteis tais como a insulina humana, hormônio de crescimento, vacinas e enzimas industriais em grandes quantidades. Sua aplicação comercial ou biotecnológica parece ter um potencial inesgotável. Como conseqüência do desenvolvimento desta tecnologia é atualmente possível realizar investigação de paternidade e o diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas através da análise de DNA.

2. CONCEITODE CLONAGEM MOLECULAR A origem do termo clonagem vem da Genética Bacteriana que considera uma colônia de bactérias como um clone porque todos os indivíduos são geneticamente idênticos à bactéria inicial. A técnica central da metodologia do DNA recombinante é a clonagem molecular, a qual consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas. A clonagem molecular compreende pelo menosdois estágios importantes. Primeiro, o fragmento do
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DNA de interesse chamado de inserto é ligado a uma outra molécula de DNA chamada de vetor para formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo, a molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeira compatível, num processo chamado de transformação. A célula hospedeira que adquiriu a molécula do DNA recombinante é agorachamada de transformante ou célula transformada. Um único transformante, em condições ideais, sofre muitos ciclos de divisão celular, produzindo uma colônia que contém milhares de cópias do DNA recombinante.

3. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Em 1953 foi descrito um estranho fenômeno no qual a eficiência da replicação de um bacteriófago (vírus de bactérias) dependia da célula hospedeira na qual ele estavainserido. Algum tempo depois percebeu-se que a inabilidade de certos fagos crescerem em determinadas linhagens bacterianas era devido a presença de nucleases altamente específicas que clivavam o seu DNA. Isto pode ser encarado como um sistema de defesa bacteriano que degrada DNA que lhe é estranho (restrição). A bactéria protege seu próprio DNA desta degradação “camuflando-o” através da metilação dealgumas bases específicas (modificação). Como conseqüência, este sistema é frequentemente descrito como fenômeno da restrição/modificação e existe em um grande número de bactérias. As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição são divididas em várias classes, dependendo da estrutura, da atividade e dos sítios de reconhecimento e clivagem. As enzimas do Tipo II, as mais importantes na...
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