Compte rendu biomolecules

Boutet Flavie L3 MACQ
Germain Laura Année 2010/2011
Bastos Vasques Roberta le 07/04/11
Cadoudal Marine
Baconnais Marlène

Travaux Pratiques de Biochimie

Introduction

Lors de ce TP, nous avons travaillé sur l’enzyme β-galactosidase (E.C 3.2.1.23) faisant partie de la famille des hydrolases. Sa fonction est d’hydrolyser des β-galactosides en monosacharides comme par exemple le lactose qu’il hydrolyse en glucose et galactose. Dans notre cas, nous avons hydrolysé l’ortho-nitrophényl β-Dgalactopyranoside (o-NPGal) en o-nitrophénol et galactose, en coupant la liaison osidique.

La β-galactosidase est une protéine tétramérique (118kDa) avec un poids moléculaire de 464 kDa. Son pH optimum est compris entre 6 et 8, sa température optimale est de 35°C et son point isoélectrique est de 4,6.

Chaque sous unité de la β-galactosidase est composée de 5 domaines dont le troisième forme le site catalytique de l’enzyme pouvant accueillir différents substrats spécifiques et d’analogie structurale.

Ce TP va donc nous permettre, dans un premier temps, de caractériser la β-galactosidase en évaluant son activité dans un extrait partiellement purifié et dans différentes conditions opératoires. Ensuite, nous avons purifier l’enzyme à l’aide diverses techniques chromatographiques et nous avons évaluer sa stabilité à diverses conditions de températures et de pH.

Evaluation de l’activité dans un extrait partiellement purifié

Détermination du coefficient d’extinction molaire du produit de la réaction:

Dans cette partie, nous avons fait varier la concentration d’o-NitroPhénol (oNP) afin de déterminer son coefficient d’extinction molaire Ɛ. Pour cela, 10 dilutions successives au demi ont été réalisées dans un tampon phosphate (NaH2PO4 100mM pH=7.3). Pour toutes les dilutions on aura un volume final de 3mL. La DO à 415 nm sera alors mesurée pour chaque tube.

|Concentration |0,00488 |
|oNP mM | |
|1