Compte rendu biomolecules

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  • Publicado : 7 de outubro de 2011
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Boutet Flavie L3 MACQ
Germain Laura Année 2010/2011
Bastos Vasques Roberta le 07/04/11
Cadoudal Marine
Baconnais Marlène

Travaux Pratiques de Biochimie

Introduction

Lors de ce TP, nous avons travaillé sur l’enzyme β-galactosidase (E.C 3.2.1.23) faisant partie de la famille des hydrolases. Sa fonction est d’hydrolyser des β-galactosides en monosacharides comme par exemple lelactose qu’il hydrolyse en glucose et galactose. Dans notre cas, nous avons hydrolysé l’ortho-nitrophényl β-Dgalactopyranoside (o-NPGal) en o-nitrophénol et galactose, en coupant la liaison osidique.

La β-galactosidase est une protéine tétramérique (118kDa) avec un poids moléculaire de 464 kDa. Son pH optimum est compris entre 6 et 8, sa température optimale est de 35°C et son pointisoélectrique est de 4,6.

Chaque sous unité de la β-galactosidase est composée de 5 domaines dont le troisième forme le site catalytique de l’enzyme pouvant accueillir différents substrats spécifiques et d’analogie structurale.

Ce TP va donc nous permettre, dans un premier temps, de caractériser la β-galactosidase en évaluant son activité dans un extrait partiellement purifié et dans différentesconditions opératoires. Ensuite, nous avons purifier l’enzyme à l’aide diverses techniques chromatographiques et nous avons évaluer sa stabilité à diverses conditions de températures et de pH.

Evaluation de l’activité dans un extrait partiellement purifié

Détermination du coefficient d’extinction molaire du produit de la réaction:

Dans cette partie, nous avons fait varier laconcentration d’o-NitroPhénol (oNP) afin de déterminer son coefficient d’extinction molaire Ɛ. Pour cela, 10 dilutions successives au demi ont été réalisées dans un tampon phosphate (NaH2PO4 100mM pH=7.3). Pour toutes les dilutions on aura un volume final de 3mL. La DO à 415 nm sera alors mesurée pour chaque tube.

|Concentration |0,00488 |
|oNP mM | |
|1|0,278 |
|2 |0,361 |
|3 |0,444 |
|4 |0,529 |
|5 |0,615 |
|6 |0,702 |
|7 |0,784 |
|8 |0,872 |
|9 |0,955 |
|10 |1,038 |
|15 |1,411 |
|20 |1,668|
|25 |1,76 |
|30 |1,78 |
|40 |1,789 |
|100 |1,779 |

La courbe de la DO en fonction du temps obtenue nous permet de déterminer la ½ vie de notre enzyme.

[pic]

DOmax = 1.789
T1/2 est déterminer à partir de la courbe à DOmax/2 = 0.894 , t1/2= 8.4 min.

Cinétique en fonction de laconcentration en substrat :

Afin de suivre l’évolution de la cinétique de cette réaction en fonction de la concentration en o-NPGAL nous allons préparer des solutions à partir de 10 dilutions en série et au ½ à partir d’une solution de substrat 10mM dans du tampon phosphate 100mM.

Dans chaque tube réactionnel on introduira 2,8 ml de ces différentes solutions, auxquelles on ajoutera 100 µl d’unesolution de MgCl2 30mM.

Ce suivi se fera par spectrophotométrie, grâce à la coloration du produit, à une longueur d’onde de 415nm. Après avoir fait le zéro, nous ajouterons 100 µl de β-Galactosidase. Nous relèverons la DO toutes les 30sec pendant 3 min, pour en déduire la vitesse initiale Vi de chaque concentration de substrat.

|5mM substrat | | || | |
|DO 595nm |0,683 |0,463 |0,299 |0,19 |0,122 |
|Quantité de protéines (µg) |14,85 |10,07 |  |  |  |
|Quantité de protéines (µg) |296,96 |402,61 |  |  |  |
|avant dilution |...
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