Cinetica enzimatica

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Universidade Federal de São Paulo

Campus Diadema



Relatório do Experimento II : Cinética enzimática

Unidade Curricular: Bioquímica I

Docentes: Profª Drª Karin Argenti Simon, Prof Dr Helotonio Carvalho



Grupo:
Realização do experimento: 09/04/2012







Objetivos

Construir curva padrão de absorbância em relação a concentração de solução redutora.Com esses dados, construir a curva de dependência da concentração do substrato na velocidade inicial de reação enzimática. Determinar e estudar parâmetros relevantes como a constante de Michaelis Menten e a velocidade máxima da reação pelo gráfico de Vo versus [S] e pelo diagrama do duplo recíproco.

Introdução



Várias abordagens são comumente usadas para estudar o mecanismo de ação dasenzimas purificadas, no entanto, a principal abordagem para estudar o mecanismo de uma reação catalisada por enzima é determinar a velocidade da reação e como ela se altera em resposta a modificações nos parâmetros experimentais. Neste experimento estudaremos a influência da concentração de substrato na velocidade de uma reação enzimática.

A concentração do substrato [S] se altera duranteo curso de uma reação à medida que o substrato é convertido em produto. Uma abordagem simplificadora nos experimentos de cinética é medir a velocidade inicial (V0) quando [S] é muito maior que a concentração de enzima [E].

Em 1913 Leonor Michaelis e Maud Menten postularam que a enzima primeiro combina reversivelmente com seu substrato para formar um complexo enzima-substrato em uma etapareversível relativamente rápida, a segunda etapa é mais lenta corresponde a quebra do complexo enzimas –substrato.

Reação global simplificada:

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Quando [S] é baixa a maior parte da enzima está na forma não combinada a medida que [S] aumenta o equilibrio se desloca para formação de ES, a velocidade é proporcional a [S]. Quandovirtualmente toda enzima estiver presente no complexo ES e [E] for pequena obsrva-se a velocidade máxima inicial (Vmáx), a enzima está “saturada” de substrado e aumentos adicionais não tem efeito na velocidade.

A etapa limitante da reação nas reações enzimaticas é a quebra do complexo ES até o produto e a enzima livre, a expressão quantitativa para determinação da V0 é a equação deMichaelis-Menten:













A equação acima pode ser algebricamente transformada em equações que são mais úteis na representação de dados experimentais, como por exemplo a equação de Lineweaver-Burk, representada pelo diagrama do duplo recíproco (1/V0 versus 1/[S]), esse diagrama tem a grande vantagem de permitir uma determinação mais precisa da Vmáx .




1/V0 =Km/ Vmáx[S] +1/Vmáx







Materiais


• 15 tubos de ensaio grandes (180X 20mm);
• 1 proveta de 25mL;
• 1 pissete com água destilada;
• 1 estante para tubos;
• 9 cubetas para espectrofotômetro;
• 1 Erlenmeyer;
• 1 caixa com gelo;
• 1 caneta para marcação de tubos;
• Fita crepe;
• 1 pipeta de 2mL;
• 1pipeta de 5mL;
• Micropipetas P200 e P1000 e respectivas ponteiras;
• Banho fervente;
• Banho a 37ºC;
• Tampão acetato 0,02M;
• Sacarose 100mM em tampão acetato;
• Solução padrão redutora 12mM (6,0mM de glicose + 6,0mM de frutose);
• Ácido 3,5 Dinitrosalicílico (DNS);
• Solução de enzima invertase (8(g/mL).

Procedimentoexperimental

A) Construção da curva padrão


Foram colocados em um tubo de ensaio, o qual chamaremos de branco, 2,0mL de solução tampão acetato e 2,0mL de DNS. Cinco tubos de ensaio foram numerados de 1 a 5 e colocou-se 2,0mL de DNS em cada tubo de ensaio. Então, colocaram-se 0,2mL, 0,4mL, 0,6mL, 0,8mL e 1,0mL de solução padrão redutora e 1,8mL, 1,6mL, 1,4mL, 1,2mL e 1,0mL de tampão...
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