Caseina

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PRÁTICA Nº 5: DETERMINAÇÃO DE
KM E VMAX PARA A HIDRÓLISE DE
CASEÍNA COM TRIPSINA

Objetivos
Iremos realizar reações de hidrólise de
caseína (preparada na aula prática nº 4) com a
enzimatripsina;
 Com isso, através de métodos
espectrofotométricos, obteremos a
concentração final da substância e assim
traçaremos curvas de Michaelis-Menten e de
Lineweaver-Burke para estimar valores deVMAX e KM para a hidrólise tríptica da Caseína;


Modelo de Michaelis-Menten


Enzima (E) combina-se de modo reversível com o
substrato (S), formando um estado intermediário
complexoenzima-substrato (ES) de forma reversível e
rápida:

E+S


κ2

ES

Complexo ES é rompido em uma segunda etapa que é
mais lenta, fornecendo enzima livre (E) e o produto (P).

ES


κ1

κ3κ4

E+P

Como a segunda reação é a mais lenta, esta deve
limitar a velocidade da reação total.

Equação de Michaelis-Menten


Considerando a reação total:
κ1
E+S
ES κ3
E+P
κ2(obs.: como é assumido que está em fase inicial da reação, K4 é desconsiderado.)



Considerando um estado estacionário:

Velocidade de formação de ES = Velocidade de decomposição de ES
Assim:
K1[E][S] = (K2 + K3) [ES]



Onde:

Km = constante de Michaelis - Menten e é uma medida de afinidade
da enzima pelo substrato.

Equação de Michaelis-Menten


Como a enzima total([Et]) corresponde a soma de [E] com
[ES] ou seja [E] = [ETOTAL] - [ES]:



Após operações matemáticas e considerando Vo = K3 [ES], Vo é
a velocidade inicial da reação:



Quando todas asenzimas estão na forma do complexo [ES],
[Etotal] = [ES], assim:

Equação de Michaelis-Menten

Gráfico da variação
da velocidade
inicial versus a
concentração do
substrato:

Gráfico deLineweaver-Burk


Um outro modo de determinar KM e VMÁX é
invertendo a equação de Michaelis-Menten:

Que representa uma equação do tipo Y = ax + b,

Onde:
b = coeficiente linear =


θ

a...
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