Caseina

PRÁTICA Nº 5: DETERMINAÇÃO DE
KM E VMAX PARA A HIDRÓLISE DE
CASEÍNA COM TRIPSINA

Objetivos
Iremos realizar reações de hidrólise de caseína (preparada na aula prática nº 4) com a enzima tripsina;
 Com isso, através de métodos espectrofotométricos, obteremos a concentração final da substância e assim traçaremos curvas de Michaelis-Menten e de
Lineweaver-Burke para estimar valores de
VMAX e KM para a hidrólise tríptica da Caseína;


Modelo de Michaelis-Menten


Enzima (E) combina-se de modo reversível com o substrato (S), formando um estado intermediário complexo enzima-substrato (ES) de forma reversível e rápida: E+S


κ2

ES

Complexo ES é rompido em uma segunda etapa que é mais lenta, fornecendo enzima livre (E) e o produto (P).

ES


κ1

κ3 κ4 E+P

Como a segunda reação é a mais lenta, esta deve limitar a velocidade da reação total.

Equação de Michaelis-Menten


Considerando a reação total: κ1 E+S
ES κ3
E+P
κ2

(obs.: como é assumido que está em fase inicial da reação, K4 é desconsiderado.)



Considerando um estado estacionário:

Velocidade de formação de ES = Velocidade de decomposição de ES


Assim:
K1[E][S] = (K2 + K3) [ES]



Onde:

Km = constante de Michaelis - Menten e é uma medida de afinidade da enzima pelo substrato.

Equação de Michaelis-Menten


Como a enzima total ([Et]) corresponde a soma de [E] com
[ES] ou seja [E] = [ETOTAL] - [ES]:



Após operações matemáticas e considerando Vo = K3 [ES], Vo é a velocidade inicial da reação:



Quando todas as enzimas estão na forma do complexo [ES],
[Etotal] = [ES], assim:

Equação de Michaelis-Menten

Gráfico da variação da velocidade inicial versus a concentração do substrato: Gráfico de Lineweaver-Burk


Um outro modo de determinar KM e VMÁX é invertendo a equação de Michaelis-Menten:

Que representa uma equação do tipo Y = ax + b,

Onde: b = coeficiente linear =


θ

a =