Camundongos transgênicos

Disponível somente no TrabalhosFeitos
  • Páginas : 11 (2652 palavras )
  • Download(s) : 0
  • Publicado : 6 de janeiro de 2011
Ler documento completo
Amostra do texto
Camundongos transgênicos

Animais transgênicos são aqueles que tiveram seu genoma alterado pelo recebimento de um gene de outra espécie. A tecnologia dos transgênicos permite inserir proteínas exógenas de interesse em camundongos e examinar as conseqüências. A técnica mais comum consiste na microinjeção direta do gene de interesse no pró-núcleo de ovos fertilizados. Uma micropipeta devidro contendo a solução de DNA (~2 pmol) é introduzida no prónúcleo de um ovo fertilizado. Os embriões são cultivados e reimplantados em uma fêmea. Os filhotes que receberam o gene de interesse (no máximo 40% dos filhotes) são identificados por “Southern Blot”: o DNA dos animais é extraído e fragmentado; os fragmentos de DNA são separados por eletroforese em gel, transferidos para uma membrana, e ogene de interesse é identificado por uma sonda marcada de RNA ou DNA complementar. No método de microinjeção pró-nuclear, a recombinação é não-homóloga, ou seja, ocorre ao acaso no genoma das células do animal (Fig. 1).

[pic]

Por ser aleatória, a integração do transgene ao DNA pode resultar na mutação de outro gene (e não do gene-alvo). Também há variações no número de cópias integradas e nonível de expressão do transgene, ou seja, na quantidade produzida da proteína correspondente. Além disso, como o gene-alvo continua intacto, não se sabe a priori como sua expressão será afetada pelo transgene. Isso exige a geração de várias linhagens independentes de animais com o mesmo transgene, para comparar o efeito no organismo de diferentes doses da proteína em estudo.

Técnica de injeçãode células tronco embrionária murina (ES)

Um método alternativo para introduzir genes estranhos ou seqüências alvo dos genes em camundongos consiste na utilização de células tronco embrionária murina (ES). Estas células são pluripotentes e podem ser proliferadas e diferenciadas em meio de cultura, ou serem incorporadas a um blastocisto de camundongo, que pode então ser implantado em umamãe pseudo-grávida e induzido a se desenvolver. A injeção em blastocistos dá origem a quimeras, permitindo a transmissão para o organismo de mutações aleatórias induzidas no período de cultura ou de transgenes introduzidos nas células ES (Fig.2).
[pic]
Fig. 2 Os diferentes estágios na criação de camundongos geneticamente modificados via células ES

Camundongos nocautes

Uma variaçãoda tecnologia dos animais transgênicos é o nocaute do gene de interesse. O nocaute é a interrupção do gene in vitro provocada por mutações, deleção ou inserção de um fragmento de DNA, o qual interfere na fase de leitura, resultando em uma proteína não funcional. O gene mutante é flanqueado por seqüências de DNA homólogas àquelas que flanqueiam o gene alvo no cromossomo, para favorecer arecombinação homóloga (recombinação precisa com a seqüência idêntica no genoma), o gene mutante é então inserido em um vetor e introduzido em células tronco embrionárias (ES) em cultura por microinjeção, transfecção ou eletroporação. Recombinações resultando na substituição do gene normal ocorrem cerca de uma em cem vezes. As células recombinantes são selecionadas e injetadas em um blastocisto, o qual éintroduzido em uma fêmea. Algumas das células do filhote possuirão o gene mutante. Se for o caso de células germinativas, o cruzamento deste camundongo com um nativo resultará em filhotes heterozigotos – expressando somente 50% da proteína. Do cruzamento de camundongos heterozigotos obtém-se animais homozigotos (com 25% de freqüência) com as duas cópias do gene mutadas, ou seja, com expressão nula daproteína (Fig.3).

[pic]

Os camundongos quimeras obtidos pela técnica de mutação dirigida de um gene são cruzados com animais de pêlo preto (não-agouti).
A prole terá camundongos tanto pretos quanto marrons. Os marrons têm o gene agouti, herdado do gameta da quimera derivada das células ES mutadas. A análise do DNA revela quais deles têm um alelo mutante (KO) do gene-alvo (WT)....
tracking img